副溶血弧菌噬菌体的分离鉴定、裂解性能及在副溶血弧菌快速检测中的初步应用.pdfVIP

谨以此论文献给我最挚爱的导师王静雪副教授、 林洪教授及我最挚爱的家人。 彭 勇 副溶血弧菌噬菌体的分离鉴定、裂解性能 及其在副溶血弧菌快速检测中的初步应用 摘要 副溶血弧菌( Vibrio. parahaemolyticus) ，又称嗜盐菌，广泛分布在海水、 淤泥以及鱼虾贝类等水产动物体内，能引起虾红体病、鱼类皮肤溃烂等水产 动物疾病，是水产养殖业的主要致病菌之一。人体食用被副溶血弧菌感染的 水产动物，可引起急性肠胃病，若食物中副溶血弧菌含量超过 106 可引起败 血症甚至死亡。据我国食源性疾病监测网数据显示，副溶血弧菌引起的食物 中毒的规模与人群暴露范围已成为沿海省份微生物中毒的首要因素。 目前副溶血弧菌的检测方法主要分为传统分离鉴定法与免疫学、核酸等现代 检测方法。传统方法步骤繁琐，检测周期长，不能满足水产品致病菌快速检测的 需要；现代检测方法在检测速度、灵敏性等方面有了很大提高，但是也存在样品 前处理复杂、仪器化程度高、检测成本高等缺陷，尤其是不能实现目标病原体的 特异性检测。建立一种快速、简便、灵敏、特异性强的检测方法有很重要的现实 意义。本研究从筛选高效副溶血弧菌噬菌体出发，利用噬菌体的高度宿主专一性 实现副溶血弧菌的特异性检测，结合细菌荧光素酶-FMN:NADH 氧化还原酶体外 发光体系实现副溶血弧菌的快速检测。主要研究内容如下： 1 以副溶血弧菌VP 17802 为宿主菌，采用双层琼脂平板法从污水样品中分 离得到 3 株副溶血弧菌噬菌体 VPp1 、VPp2 、VPp3 ，经液体增殖法与固体增殖法 增殖后该噬菌体的效价较高，能达 1010 pfu/mL 以上。双层琼脂平板 37°C 恒温 培养 12 h 后出现清晰透亮的噬菌斑。VPp1 所形成的噬菌斑较小，边缘模糊，有 大而明显的晕环，VPp2 、VPp3 所形成的噬菌斑中等大，边缘清晰，有较小或没 有晕环。 2 对 VPp1 、VPp2 、VPp3 进行初步鉴定及电镜观察显示，结果表明：VPp1 、 VPp2 、VPp3 分属三株不同的噬菌体；遗传物质均为双链 DNA ；都有一个正二 十面体的头部，头部直径分别为 44 nm 、64 nm、89 nm。VPp1 无尾，属盖噬菌 体科，VPp2 、VPp3 分别有一条 114 nm 与 106 nm 的尾部，属于肌尾噬菌体科。 3 对 VPp1 、VPp2 、VPp3 进行裂解性能分析比较，结果表明：3 株噬菌体的 最佳感染复数都比较小，分别为 0.0001 、0.00001 、0.001 ；潜伏期分别为 10 min、 5 min 、25 min ；裂解期分别为 20 min 、25 min 、75 min ；裂解量分别为 90.3 、 11.1、45.3 。综合分析各因素，发现 VPp1 是符合条件的潜伏期短裂解量大 的理想噬菌体株系，因此选定 VPp1 用于后续实验。紫外线照射实验结果表 明 VPp1 对紫外线非常敏感，照射 20 s 存活率即下降 60% 以上，照射 1 min 存活率只剩下 13%。VPp1 全基因组序列包含 64 个推定基因，每个推定基 因在数据库上进行同源性比对分析，结果表明 VPp1 是一株新发现的噬菌体。 4 为了使细菌细胞内的 NADH 更多的释放到胞外，本研究从噬菌体效 价、裂解时间、噬菌体与宿主菌的体积比三个方面进行噬菌体裂解宿主菌 的裂解条件优化，结果表明：噬菌体效价越高越能在短时间内将宿主菌裂 解完全，考虑到噬菌体增殖液制备的便利性，检测体系中确定噬菌体的效 价为 1010 pfu/mL ；裂解时间为 15 min；体积比为 1:1。 5 将噬菌体 VPp1 结合细菌荧光素酶-FMN:NADH 氧化还原酶体外发光体系 8 进行副溶血弧菌的定量检测，结果表明：副溶血弧菌的数量在 0