Bacillus.sp.bs-1的内切葡聚糖酶在大肠杆菌中的表达的研究.pdfVIP

摘 要 纤维素是世界上最丰富的天然有机物，是一种廉价可再生资源，它的开 发和利用具有深远的意义。利用纤维素酶降解纤维素是一种有效而环保的途径， 而且纤维素酶的应用范围广。因此，对纤维素酶及其应用的研究逐渐成为了人们 关注的热点。目前，对内切葡聚糖酶的研究较多。 孙麟完成了一株纤维素酶活性比较高的枯草芽孢杆的菌筛选及分离，对其进 行了分子鉴定，并命名为Bacillus. Sp. bs-1，并成功克隆了其内切葡聚糖酶基因。 本研究在这基础上，构建不同原核表达载体，并在大肠杆菌中进行了可溶性过表 达的研究。本研究的目的是对表达载体进行比较，研究它们的表达效率，同时也 对表达条件进行优化，为内切葡聚糖酶的可溶性过表达研究打基础。 本研究成功的构建成了三个不同的表达载体，即 pQE-30-C 、pET-30a-C 、 pET-28a-C ，并对其表达效果进行了比较。通过摸索适合的表达条件，确定了 pET-30a-C 、pET-28a-C 表达的内切葡聚糖酶的最佳可溶性诱导表达条件。 pET-30a-C 表达的内切葡聚糖酶在25 ℃，用1mM 的IPTG 诱导3 小时就可以达 到最佳可溶性表达量。pET-28a-C 表达的内切葡聚糖酶在25 ℃，用0.8mM 的IPTG 诱导5 小时能够达到最佳可溶性表达量。对构建的pET-30a-C、pET-28a-C 表达 的内切葡聚糖酶活性进行了测定，并确定了最适反应条件。pET-30a-C 表达的内 切葡聚糖酶在底物缓冲液（以CMC-Na 为底物，pH7.0 ）50℃保温30min 时酶的 活性最高，酶活性为 1489U/mL，pET-28a-C 表达的内切葡聚糖酶在底物缓冲液 （以CMC-Na 为底物，pH3.0 ）55℃保温 30min 时酶的活性最高，酶活性为 683U/mL 。用Ni-NTA 树脂纯化了pET-30a-C、pET-28a-C 表达的内切葡聚糖酶蛋 白，得到单一的目的蛋白，并测定了纯化后的内切葡聚糖酶的比活力。pET-30a-C 表达的内切葡聚糖酶纯化后的酶的比活力为723U/mg，pET-28a-C 表达的内切葡 聚糖酶纯化后的酶的比活力为808U/mg。此结果为枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶在 工业应用方面提供了理论依据。 关键词：内切葡聚糖酶；表达载体；表达条件；纯化 Study on expression of endoglucanase of Bacillus.sp.bs-1 in E. coli Abstract Cellulose is the most abundant natural organic material in the world. It is a cheap and renewable natural resource, its utilization has a significant meaning. Degradation of cellulose by cellulase is an effective and environment freindly way for its utilization, and cellulase has wide application range, Therefore, application of cellulase has been becoming the focus of the reasarch in this field. At present, studying on endoglucanase is relatively intensive in this research area. This study was carried out on the basis of former research, in which a Bacillus subtilis strain with higher cellulase activity has been screened and separated, and its