放射免疫分析法的建立.pdfVIP

中国试剂网 2.4.94 放射免疫分析法的建立 一、放射免疫分析的基本试剂 （一）标准品 标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质 的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为 定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性， 即在合理的贮存条件下保持原来的特性。 按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准 曲线。 （二）标记物 标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③ 所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原 尤其重要；④标记简便、易防护。 要准确测量 B 与 F 的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗 原的量，在使用 125I 时达 5000～15000cpm。 （三）抗体 应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。 根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为 50%作为抗血清的稀释 度。 （四）B 与 F 分离剂 以 2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制： 活性炭 2g （杭州木材厂生产，森工牌732 型） 右旋糖酐 T200.2g 加 0.1mol/L PB 至 100ml 电磁搅拌 1h，然后置于变通冰箱冰箱待用。 （五）缓冲液 放射免疫分析技术所用的缓冲液有多种，要通过实验选用抗体和抗原结合最 高的缓冲液。 目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓冲液；②醋酸盐缓冲液；③巴 中国试剂网 2.4.94 比妥缓冲液；④Tris –HCl 缓冲液；⑤硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最 多。 在缓冲液中，除必须有弱酸及弱酸的盐成分外，还应根据不同检测项目加入 下列物质：①保护蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明胶，浓度为 0.1%～0.2%， 用以降低试管对抗原的非特异性吸附。②防腐剂：多采用 0.1%叠氮钠、0.01%柳 硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制剂：如测定心钠素等肽类激素时，要加入适量 的抑肽酶，用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解；又如测定 cAMP、cGMP 时，需加入EDTA·2Na ，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻断剂：在测定甲状腺激素 或测定某些甾体激素时，必须加阻断剂，使和蛋白质相结合的激素，变为游离型。 常用的阻断剂有 8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。⑤ 载体蛋白：采用二抗作 B 与 F 分离剂时，要向反应液中加入适量与第一抗体同 种动物的正常血清。在测定不含有血浆蛋白的样品时，用 PEG 沉淀剂分离 B 、F ， 必须加适量 γ球蛋白或正常人混合血清。 在神经肽的 RIA 时，常用PELH 缓冲液，（按1000ml,pH7.6）： 0 ．1mol/l PB 980.0ml 0.3mol/L EDTA·2Na 10.0ml 0.2%洗必泰溶液 10.0ml 溶菌酶 1.0g 二、加样程序 由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述 如下： （一）平衡饱和加样程序 1．基本原理所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到再不结合，也不解离 的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。这意 味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。 2 ．加样程序一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这 样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。 在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲 合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。因此，上述加样程序就更有必要， 中国试剂网