《《血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳》》.pptVIP

二、实验原理 电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此可使它们分离 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状 按支持介质不同可将电泳分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 另外，还可以按分离原理不同、支持介质形状不同、用途不同以及所用电压不同等将电泳分类 电泳的装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移；电泳槽可以分为水平式和垂直式两类 四、实验材料与试剂 人血清（从血站购买） 巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07） 染色液（氨基黑10B） 漂洗液 * 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 一、实验目的 了解电泳技术的一般原理 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作 采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小 醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术，它具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白 三、实验器材 醋酸纤维薄膜（2×8 cm） 常压电泳仪 点样器（盖玻片） 培养皿 粗滤纸 载玻片 镊子 五、实验操作 浸泡：将2×8 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡30 min方可用于点样 点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一 载玻片上滴一滴血清，点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线 电泳槽的准备：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥 电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。通电，调节电压至160 V，电流强度为0.4～0.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约25 min 染色：电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5 min 漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱 六、注意事项 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在15～30 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳 醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥－巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.05～0.09 mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果 点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4～0.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散 操作过程为防止指纹污染，应戴手套 七、实验思考 用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？ 电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？