β-榄香烯诱导的缺氧诱导因子对其引发MG-63细胞凋亡的保护作用的研究.pdf

·中文论著摘要· B．榄香烯诱导缺氧诱导因子对其引发MG．63细胞凋亡 的保护作用研究 目 的 榄香烯是从中药莪术中提取的抗癌药物，p．榄香烯是其主要活性成分，目I；i『 研究表明p．榄香烯由于药物的毒副作用较小，已在抗癌领域被逐渐接受，并且表 现出良好的抗癌效果。但是关于榄香烯治疗骨肉瘤目前尚无人报道。我们应用不 同浓度的榄香烯作用于人骨肉瘤细胞系MG．63细胞，观察其对细胞增殖和凋亡的 影响。并探索其凋亡的机制。目前对于骨肉瘤的治疗主要是手术配合化疗，但是 化疗会经常会有耐药现象产生影响了药物本身的效果。而缺氧诱导因子与这样的 现象有密切的关系。我们通过实验论证在p．榄香烯作用过程中缺氧诱导因子是否 会发生量的变化，以及分析其发生变化的机制，进而论证这种变化对细胞凋亡存 活的影响，及对化疗效果的影响。最后应用转染和干扰技术验证缺氧诱导因子对 细胞凋亡和存活的影响。对临床的治疗提供科学的依据。 方 法 1、成骨细胞加入榄香烯后的增殖率测定。 换培养液，分别加入不同浓度的p．榄香烯，复合培养24，48和72h后。加入MTT， 酶标仪测量490nm波长的吸光度值(OD)。分析细胞的增殖和凋亡情况。 2、成骨细胞细胞周期检测。 加入榄香烯复合培养后，加入配制好的PI染液于37度水浴中避光孵育30分 钟。孵育好的细胞采用流式细胞术上机检测细胞周期情况。 凋亡情况。 避光孵育lO分钟后，上机检测。 3,9等凋 达情况。 加入蛋白裂解液裂解。收集蛋白样品后测定蛋白样品的浓度，加入适量的上 样缓冲液，煮沸5分钟后，冷却到室温后就可以上样，将样品加入到SDS．PAGE 转膜2小时，封闭两小时后，用相应抗体孵育过夜，第二日清晨加入对应的辣根 过氧化物酶标记的二抗孵育2小时，最后采用ECL试剂来检测。 5、免疫荧光检测各组MG．63细胞HIF．1a蛋白的表达情况。 加入榄香烯复合培养后，收集细胞，再以4％的多聚甲醛固定l小时。加入 条件下孵育过夜。用PBS缓冲液冲洗孑L板，吸取一抗残液，避光下分别加入TRITC 过PBS冲洗后在荧光显微镜下观察，并拍照。 6、应用流式细胞术，采用ROS检测试剂盒检测各组别的ROS情况。 细胞内的ROS水平采用DCFH．DA荧光探针进行检测。加入处理药物作用后加 h，每5 入终浓度30肛M的DCFH．DA于37C孵育lrain震荡细胞一次。用无血清的 D．MEM培养基沈细胞3次后，用流式细胞术检测。 7、RT-PCR检测各组MG．63细胞HIF．1amRNA的表达情况。 加入榄香烯复合培养后，收集细胞总RNA，反转，PCR扩增，然后将PCR产 物做琼脂糖凝胶电泳，并作分析。 8、稳定表达HIF．1a细胞株的建立和鉴定。 14天后，提取转染细胞的RNA和总蛋白做鉴定。 9、RNA干扰抑制HIF．1a的表达。 2 将干扰质粒转染人骨肉瘤细胞系MG．63细胞，提取转染细胞的RNA和总蛋 白做鉴定。检测干扰效果。 10、统计学处理。 数据均以均数4-标准差表示，采用SPSSl7．0软件包进行统计学处理，各组间 比较采用单因素方差分析，样本均数间的两两比较采用LSD．t检验，以P0．05 为差异有显著性。 结 果 l、榄香烯处理MG．63细胞后，细胞生存率逐渐减小，细胞凋亡明显增加， 具有剂量依赖性和时间依赖性的特点。 2、加入榄香烯后，细胞周期停留于GO／G1期，处于G0／G1阻滞，细胞的增 殖受到了抑制。 3、榄香烯引起的MG．63细胞凋亡是一种线粒体依赖的凋亡。榄香烯同时激 活了c勰pase依赖性的和caSpaSe非依赖性的两条凋亡途径。 4、加入榄香烯后，发现HIF．1a的表达增加。无论是从蛋白水平还是转录水 平，加入榄香烯后，HIF．1u的表达明显增加。 5、B．榄香烯作用的最初阶段，即在细胞凋亡早期，P13K／AKT