农杆菌介导薰衣草转化体系建立及冷诱导基因导入.pdf

摘 要 薰衣草是唇形花科薰衣草属多年生半阴性亚灌木植物，原产于地中海地区，是主 要的天然香料植物之一。由于薰衣草在我国境内难以安全越冬，其种植区域及商业利 用都受到了约束。运用基因工程技术，通过有针对性的转基因改良方法，可以在提高 薰衣草耐寒能力的同时，改善薰衣草精油的质量和产量。本研究在优化薰衣草再生系 统和农杆菌介导遗传转化体系的基础上，采用农杆菌介导法获得了含雪莲冷诱导基因 XCH 的转基因薰衣草，以期提高薰衣草抗寒能力和精油产量，同时为利用转基因 技术改良薰衣草耐寒能力和品质提供参考依据。主要研究结果如下： 1． 通过试验确定了薰衣草 Lavandula 培养的最佳培养基，并对多种影响因素进行了研究。结果表明，薰衣草茎段直接再生 2．0 的最佳培养基为：MS讣舱AO．5mg／L+6-BAmg／L。薰衣草愈伤组织高频再生体 O．1 系为：愈伤诱导继代培养基MS+2，4-D mg／L+6一BA0．5mg／L，芽分化培养基MS+ NAA0．5 2．0 mg／L+6．BAmg／L。将不同外植体来源的薰衣草再生芽丛中较粗壮的的单 2．0 O．5 芽切下后接种在芽继代培养基MS+NAAmg／L+6一BAmg／L上，壮苗30d左右， 转入生根培养基I／2MS+IAA0．5 mg／L+6-BAO．1mg／L后可获得薰衣草的组培再生苗。 因素的研究，初步建立了根癌农杆菌介导的薰农草叶片来源的愈伤组织和茎段的遗传 转化体系。愈伤组织的遗传转化最适条件为：在MS+2．4．DO．1mg／L+6-BA0．5 mg／L培 养基上继代2周，大小为2～3mm2的愈伤组织，经OD600O．5左右的农杆菌侵染10 mill，共培养2 d； Cef的脱菌浓度为200 d，延迟筛选lO mg／L，Hyg的筛选浓度为 10 mg／L，筛选抗性愈伤4周，30mg／LHyg继续筛选抗性愈伤，10mg／LHyg芽分化 生长筛选浓度，5mg／LHyg生根抗性筛选浓度。茎段遗传转化最适条件为：在MS+ NAAO．5 O．5左右的农杆菌侵 mg／L+6-BA2．0mg／L培养基上，预培养3d，经OD600 染15min，共培养3d，延迟筛选7 茎段分化抗性筛选浓度，5mg／L Hyg生根抗性筛选浓度。 两种转化系统所获得的GFP瞬时表达率都很高，均在90％以上。愈伤组织筛 选3周后，抗性愈伤率为37．7％。茎段在筛选培养基上筛选3周后，抗性率为15．6％。 i 但最后仅愈伤组织再生系统获得了l棵转基因苗。 3． 对通过愈伤组织再生系统获得的转基因植株进行PCR扩增，得到了与阳性对照 XCH 643bp 目的基因相同的特异片断，从分子水平上证明了目的基因已经整合到 薰衣草基因组中，转化率达到1．03％。 关键词：薰衣草，农杆菌，冷诱导基因，愈伤组织，茎段 Abstract ofthe naturalalomatic a Lavandula CV．Munstead,one angustifolia major plants，is to areas．Duetothe oftheLabiataenativeMediterranean subshrub family perennial plant zoneand difficult ofLavandulainChina,its economic overwintering angustifolia planting valuesarerestricted．Therefore．itis touse to urgent transgenicengineeringtechnique ofLavandula the and ofits thecoldtolerance output improve angustifolia．Andquality be at time．IntIlis Lavandula essentialoilscould the$alne study．transgenicplant improved wereobtained coldinducedXCH containing gene through Was onthe andtransformation transformation,basedoptimizationofregeneration system．It cold andessentialoil ofLavandula thatthe tolerance production angustifo妇CV． hoped Munsteadcouldbe informationwas forthe improved．Useful prov