微孢子虫起源及进化的PCR快速检测家蚕微粒子病.pdf

论文摘要 微孢子虫的起源与进化及PCR快速检测家蚕微粒子病 摘要 微微孢子虫（Microsporidia ）是一类广泛存在的，极其古老的专性细胞内寄 生的原生生物，能感染从无脊椎动物到人的几乎所有的动物，是许多昆虫、鱼类、 皮毛动物、啮齿类的重要病原。目前已发现的微孢子虫种类超过 1500 种，分别 划入约 120 个属。能感染家蚕的有微粒子属（Nosema ），具褶孢虫属 （Pleistophora ），泰罗汉孢虫属（Thelohania），内网虫属（Endoreticulatus ）等， 其中Nosema 属是微孢子虫中最具有代表性的属之一，它的主要宿主是昆虫，也 与某些有免疫性疾病的人的创伤性角膜炎有关联。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis ）不仅是有记载以来人类最早发现的微孢子虫，更是Nosema 属的典型 种，由它寄生家蚕所产生的蚕病，称为家蚕微粒子病。微粒子病是一种重要的蚕 病，是世界上所有养蚕国家的检疫对象。由于其特殊的经卵传染方式，往往对蚕 业生产，尤其是蚕种生产造成严重的损失。尽管微孢子虫是一种真核生物，但是 它们缺少一般被认为是真核生物所特有的特征，因此它曾被认为是第一个从真核 生物分化出来的。但近年来的许多研究结果表明微孢子虫与真菌特别是子囊菌关 系相近。本文通过克隆3 种Nosema 属（Nosema bombycis ，Nosema antheraea ， Nosema sp. ）和未进行分类鉴定的3 种Microsporidium 属(Microsporidium sp.1， Microsporidium sp.2，Microsporidium sp.3)微孢子虫及两种家蚕常见的真菌病病原 白僵菌（Cordyceps bassiana strain01 ）和黄僵菌（Cordyceps bassiana strain02 ）的 beta-tubulin 基因，采用 MEGA, Phylip, treeview, Mr.bayes 等系统发育软件和 Neighbour -Joining, Maximum Likelihood, Bayesian methond 等方法进行了系统发 育分析。 为了建立利用 PCR 快速诊断家蚕微粒子病的技术，根据Nosema 属微孢子 虫的ssu rRNA 序列，设计了一对通用引物，能对Nosema 属所有微孢子虫进行 特异性扩增，另外根据Nosema bombycis 的变异区域，设计了一对特异性引物， 理论上只能对Nosema bombycis 进行特异性扩增，并且设计了相应的PCR 反应 体系。将该技术体系应用于蚕卵的微粒子病检测，结果显示具有良好的特异性和 灵敏度。 本文首先介绍了微孢子虫作为一种在分类地位上有争议的物种，其独特的一 1 论文摘要 些特征，以及学术界对于微孢子虫进化研究的一些重点和热点。 然后，介绍了本文实验材料，6种微孢子虫和2种真菌的来源以及基因组DNA 的提取方法，引物设计，PCR反应条件，载体连接，测序，序列登陆等一系列操 作手段和方法。 其次，通过 MEGA,PHYLIP,Mr.Baye s 等生物信息学软件和 Neighboyr -Joining ，Maximum Likelihood ，Bayesian 等方法，构建系统发育树， 研究微孢子虫的系统发育。 最后，构建一套PCR检测蚕卵微粒子病的体系，为口岸检测提供技术支持。 主要得出了以下结论：3种未进行分类鉴定的 Microsporidium 微孢子虫的 beta-tubulin 核苷酸序列与已知的Nosema 属微孢子虫同源性达到98%以上，应归 属于Nosema 属；本实验研究的6种微孢子虫最后的系统发育结果显示蓝叶虫微 孢子虫在系统进化图上与其它几种分成2支，显示有一定的差异，可能是因为其 寄主为鞘翅目昆虫，与其它几种有一定的差别，导致其产生分化；系统发育树结 果证实微孢子虫确实与接合菌关系紧密，特别是几类寄生性与微孢子虫相似的虫 生真菌；家蚕病原真菌白僵菌和黄僵菌在外形，颜色上