肠道病毒71型层析纯化.pdf

手足口病是儿童流行疾病中比较常见的疾病之一，许多种肠道病毒都可以引 起手足口病，近几年来在我国以肠道病毒71型(EV71)为主要的病原体。自1997 年以来，EV71病毒的流行在亚太地区呈现上升的趋势，甚至引起了严重的中枢神 经系统的感染或死亡，引起了人们的密切关注。由于目前还没有针对Ev71病毒的 特效药和疫苗，因此，研发一种能有效控制EV71病毒流行的疫苗已经势在必行。 本研究的目的是为建立纯化EV71病毒工艺，为以后制备EV71病毒的疫苗提供可 靠的研究数据。 本研究以EV71病毒粗提液做为研究的材料，建立了凝胶过滤层析和离子交换 层析相结合的纯化工艺，为EV71病毒纯度的提高提供了最佳的层析参数。首先， 4Fast Flow凝胶过滤层析参数的筛选，选用不同的洗脱流速、不同的 对Sepharose 样品上样量、不同缓冲溶液的pH值和不同盐浓度对EV71病毒粗提液进行连续洗 脱。结果表明凝胶过滤层析的洗脱流速、样品上样量、缓冲溶液的pH值和盐浓度 对EV71病毒均能不同程度地影响EV71病毒的分粗提液的分离效果。在实验范围 内，选择洗脱流速为60cm／h、样品的上样量为5％CV、缓冲溶液的pH值为7．5 和盐浓度为0．1mol／L时，对EV71病毒原液的分离效果比较理想。接着选用了Q XL阴离子胶作为层析介质来纯化EV71病毒原液。影响离子交换层析的 Sepharose 因素有离子强度、pH、温度和流速等，本文主要探讨了离子强度和pH对离子交换 制备EV71病毒的影响。先采用线性梯度洗脱法，初步筛选制备EV71病毒平衡缓 冲液含氯化钠的浓度范围和洗脱缓冲液中氯化钠的浓度；然后在同一pH条件下， 改变平衡缓冲液中氯化钠的含量，计算在每种平衡缓冲液下EV71病毒的效价和滴 度，选择最佳的平衡缓冲液的氯化钠的含量；再在同一离子强度条件下，改变pH 值，通过计算EV71病毒的效价和滴度，选择最佳pH值。最后通过正交法去验证 了不同离子强度和pH值组合，从而筛选出了最佳层析参数。本实验可以看出离子 强度和pH值均能不同程度地影响EV71病毒的制备。在实验范围内，平衡缓冲液 交换层析相结合的方法，运用前面筛选的最佳层析参数，进行实验，得到了制备 高纯度的EV71病毒的可行性，获得了满意的结果。该工艺简单、成本低、效价和 比活高。 关键词：肠道病毒71型，病毒滴度，凝胶过滤层析，离子交换层析，离子强度， pH值 Il ABSTRACT is caused is in bymany Hand．foot．mouthdisease children，which popular 1 isonemain ofHFMDinchinathese hasbeenasignificant enterovirus．EV7 agents years．There Asia．Pacificsince hasa to increaseinEV71 inthe region 1997，andpropensity epidemicactivity andvaccineto diseaseordeath．Thereisno medicine therapy causesevere specific neurological vaccinewhichcan EV71．Soitis toresearchand one an