羊布鲁氏菌Omp25、VjbR小鼠巨噬细胞互作蛋白筛选鉴定.pdf

I 中文摘要 羊布鲁氏菌Omp25 、VjbR 与小鼠巨噬细胞 互作蛋白的筛选鉴定 布鲁氏菌病（Brucellosis ，简称布病）是由布鲁氏菌引起的一种世界性人兽 共患传染病。目前，人畜布病主要集中在发展中国家，2000 年以后，我国人畜 布病有逐年上升的趋势，给畜牧业和人的健康造成了巨大危害。布病难以防控的 原因是多方面的，其致病机制、胞内寄生机制不清楚是主要原因。布鲁氏菌能够 感染专职巨噬细胞和非专职巨噬细胞，并能在其中生存复制，其中巨噬细胞是布 鲁氏菌的主要感染对象。布鲁氏菌之所以能在巨噬细胞内寄生，推测是细菌蛋白 与宿主细胞蛋白相互作用的结果。当前，布鲁氏菌蛋白和巨噬细胞蛋白相互作用 的机制还不清楚。 Omp25 属于布鲁氏菌第 3 组外膜蛋白 Omp25/Omp31 家族中的一员，研究发 现缺失 Omp25 基因的羊布鲁氏菌突变株不会引起宿主流产，且能够在宿主体内 增殖，与其亲本株相比毒力减弱且激发体液免疫的能力也减弱，说明 Omp25 既 是毒力因子又是免疫原性蛋白。VjbR 是密度感应系统（Qurum sensing，QS ）LuxR 蛋白家族的一个转录激活因子，能够影响 IV 型分泌系统(T4SS)和鞭毛基因表达， 并且它在布鲁氏菌毒力和胞内寄生中都发挥了重要作用。鉴于此，本研究构建了 羊布鲁氏菌 16M 株感染小鼠巨噬细胞 cDNA 文库，并以 Omp25、VjbR 为诱饵 蛋白从该文库中筛选鉴定互作蛋白，为进一步研究布鲁氏菌的分子致病机制和胞 内寄生机制奠定基础。 首先，利用分子克隆技术对羊布鲁氏菌 16M 株 Omp25、VjbR 进行克隆、测 序，将其连接到 pSos 载体上，构建诱饵载体，并检测诱饵载体毒性、自激活性 以及膜定位。 其次，建立羊布鲁氏菌 16M 株感染小鼠巨噬细胞模型，提取总 RNA ，分离、 提纯 mRNA ，构建羊布鲁氏菌 16M 株感染后的小鼠巨噬细胞 cDNA 文库，将文 库连接到 pMyr 猎物载体上。 然后，将诱饵质粒和 pMyr-cDNA 文库质粒共转化 cdc25Hα 酵母感受态细胞 进行互作蛋白筛选，并应用免疫共沉淀技术进行验证。 II 通过以上实验研究，得到如下结果： 1、经过测序表明羊布鲁氏菌 16M 株 Omp25、VjbR 基因克隆正确，并且成 功连接到 pSos 载体上，构建的诱饵载体对酵母细胞无毒副作用，无自激活性， 膜上定位正确，能够用于酵母双杂交实验。 2 、利用间接免疫荧光实验和透射电镜观察，确立细菌和细胞按照 500 ︰1 的 比例进行感染，在感染 4 小时后可以成功建立羊布鲁氏菌 16M 株感染小鼠巨噬 细胞模型。 3、成功构建了羊布鲁氏菌 16M 株感染后小鼠巨噬细胞cDNA 文库，并将文 库与猎物载体 pMyr 相连，构建了 pMyr-cDNA 质粒文库。质粒库容为 9 1.6×10 cfu/mL，重组率较高。 4 、将诱饵质粒和pMyr-cDNA文库质粒共转化cdc25Hα酵母感受态细胞进行酵母 双杂交，结果筛选到2个阳性克隆，经测序两个基因分别为NDAH还原酶装备因 子 2 （Mus musculus NADH dehydrogenase (ubiquinone)1 alpha subcomplex, assembly factor 2 （NM_001127346.1 ），Ndufaf2)和核糖体蛋白S5 （Mus musculus ribosomal protein S5 （NM_009095.2 ），RPS5 ）。经免疫共沉淀验证Ndufaf2 能够与 Omp25发生相互作用，RPSs5能够与VjbR发生相互作用。通过上述试验结果，我 们提出如下假设：（1）Omp25和Ndufaf2 结合后，可以促进细胞中NADH浓度增 加，提高NADH活性，降低巨噬细胞对布鲁氏菌的氧化杀伤，从而创造了有利于 布鲁氏菌胞内生存的条件。（2 ）VjbR与RPS5结合后，抑制了RPS5活性，从而抑 制了小鼠巨噬细胞的自然凋亡，创造了有利于布鲁氏菌长期感染的环境。这为布 鲁氏菌致病机理、胞内寄生机制研究提供了新的思路。 本研究为绘制布鲁氏菌与小鼠巨噬细