鸡β--防御素--13成熟肽cDNA克隆在大肠杆菌和毕赤酵母中表达.pdf

摘 要 防御素是存在多种生物体内的一种小分子肽，具有广谱的抗细菌、真菌、病 毒等生物活性，是生物机体天然免疫的重要组成部分。依据相关报道，鸡的体内 共存在14种防御素，且均为B一防御素。用乙酸提取的方法从鸡的肠道中分离到 的鸡B．防御素13(Gal．13)，具有一定的生物活性，但提取工艺繁琐耗时，且 提取量有限。而关于用基因工程方法获得Gal一13的报道相对较少，本研究主要 原核表达载体和真核表达载体，实现其在大肠杆菌BL21和毕赤酵母x一33中的 表达，为进一步研究Gal．13的生物活性和其在畜牧业中的生产应用奠定了基 础。 1．Gal．13基因序列的扩增及其在大肠杆菌中的诱导表达 其中，信号肽序列为前20个氨基酸，前导肽序列为4个氨基酸，成熟肽序列包 育树。序列经鉴定分析后设计引物，扩增Gal．13成熟肽，并在序列中引入限制 进行诱导表达，结果显示Gal一13成熟肽在大肠杆菌中得到大量表达，且最佳诱 导表达时间为5h，最佳诱导剂的浓度为0．2 检测结果显示，表达的含有GST标签的重组蛋白分子量大小约为30ku，表明 Gal一13成熟肽序列在大肠杆菌中得到了成功表达，但主要以包涵体的形式存在， 存在于上清中的可溶性目的蛋白较少。 2．Gal一13成熟肽基因序列在毕赤酵母中的诱导表达 I 依据Gal．13基因序列重新设计引物，并在其中引入限制性内切酶EcoR 和勋nI的酶切位点，扩增Gal一13成熟肽基因序列后进行双酶切，将其插入到 万方数据 正确的重组质粒，用限制性内梅SacI进行线性化处理后，电击转化毕赤酵母X一 33，并利用甲醇对阳性重组菌株进行诱导表达，诱导表达上清用Tricine．SDS． PAGE凝胶电泳进行鉴定。结果显示，Gal．13成熟肽基因序列成功插入到表达质 粒pPICZnA中且重组质粒成功转化了毕赤酵母x一33，经过鉴定分析，获得了表 型为Mut+的高抗性重组菌株，在甲醇的诱导下，Gal．13成熟肽在菌液上清中得 13在上清中得到大量的表达，在5．9ku的位置出现了目的蛋白条带，与预期结果 (ATCC25923)均具有一定的抑制作用。 关键词：Gal一13：成熟肽；大肠杆菌；毕赤酵母；诱导表达，抑菌试验 II 万方数据 its cDNA ofGal-13mature and cloning peptide 。1’’lianandPichiala in／5．cOll nolss：preserDxettsappastons Xu of preventiveveterinary) Guo—yang(Department DirectedPan and by YangJin·-long Kang—-cheng Abstract Defensinisasmall withbroad molecI_tLepeptide spectrum viralandother in