新Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1和3D编码基因原核表达抗3D蛋白单克隆抗体制备.pdf

摘要 摘要 viral virus， 鸭病毒性肝炎(duckhepatitis，DVH)是一种由鸭肝炎病毒(duckhepatitis DHV)弓I起的急性、高度致死性传播迅速的传染病，病死率高达100％，是鸭的五大传染病 之一，对养鸭业造成严重危害。自从1945年在美国首次发现该病，其后世界多数国家相继 N株的编码结构蛋白的VPl基因和编码非结构蛋白的3D基因进行原核表达，并通过 Western-blot检测其免疫活性，再利用纯化后的重组原核表达蛋白3D作为免疫原免疫小鼠， 经过细胞融合，阳性筛选，杂交瘤细胞克隆化等步骤，成功制备l株抗DHV-1C的3D蛋 的快速诊断方法奠定了基础，并同时建立用于筛选的间接ELISA方法。 根据DHV-1C全基因序列，应用Primer5．0分析软件设计合成了扩增DHV-ICN毒株 的VPI和3D基因的两对引物，在VPI基因引物中加入BamHI和XholI酶切位点，在 3D引物中加入BamHI和Hind III酶切位点，以DHV．ICN株RNA为模板，用这两对特 BpET-30a-3D．8，将其转入宿主菌E．coli h和4 析表明，重组原核表达蛋白VPI和3D分别在诱导3h后表达量达到最高，VPl表达 产物大小约为37．68kDa，3D表达产物大小约为65．80 kDa，Western．blot分析显示二者都 能与抗DHV-IC阳性血清产生特异性免疫反应，具有很好的免疫活性，可溶性分析显示， 二者均以不溶性的包涵体形式存在于菌体中。 以纯化的重组原核表达蛋白3D为免疫原腹腔皮下注射免疫BALB／c雌性小鼠，并作为 包被抗原建立间接免疫酶联吸附(ELISA)方法。在加强免后第三天，取免疫小鼠脾细胞与 3D蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为2D9。经亚型鉴定，2D9的亚型为lgGl亚类， 力，与番鸭呼肠孤病毒oB蛋白无交叉反应，特异性良好，经Dot-ELISA分析，2D9能够 识别天然构象蛋白，经免疫组化和免疫荧光检测，2D9与感染DHV-IC的细胞发生显色反 应和免疫荧光反应，经间接ELISA测定，2D9细胞上清的效价为l：512，腹水效价为l： 256 000，检测传代30次后细胞上清效价和冻存三个月后的复苏细胞上清效价，其分泌抗 体的能力没有显著差异，表明稳定性良好。 关键词：新I型鸭肝炎病毒；VPI基因；3D基因：原核表达；单克隆抗体 Abstract 詈皇鼍111,一． 一———————暑I寡葛 of ProkaryoticExpression VPl--／3D·-encodinggenes ofnewduck 1virusand of hepatitistype Preparation MonoclonalAntibodies3D againstprotein Abstract Duckviral diseasecausedduck hepatitis(DVH)，allepidemic by hepatitisvirus(DHV)， isknown lethal，fast with cause as锄acute，highlyspreadingepidemic100％fatalityrate，and harm