6-姜酚生物学作用细胞的分子机制的研究.pdf

6一姜酚生物学作用的细胞与分子机制研究 博士生姓名：杨光 指导教师：马郁芳教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 小分子化合物。根据其结构和功能，大致可分为植物雌激素、类胡萝卜素、植物固 醇、卟啉类化合物、含硫化合物、蛋白酶抑制剂、香辛料、萜类及其衍生物、植 酸、皂甙等。近年来，利用植物化学物来治疗人类疾病，特别是治疗癌症和心血 管疾病，已经日益被公众和科学界所关注。 生姜是亚洲，特别是东南亚地区的一种重要栽培植物，我国卫生部将其列为 首批公布的药食兼用植物资源之一。植物化学物6．姜酚是生姜中提取出来的酚类 物质，是姜酚的主要成分，6．姜酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、强心、降压、降血 脂、降血糖、抗凝等多种生物学活性。其中6．姜酚抗肿瘤的作用最受关注。但其 确切的机制尚不十分清楚。 本研究以人的肝脏肿瘤细胞HepG2细胞为研究对象，探讨6．姜酚对肿瘤细胞 的遗传毒性，以及抗肿瘤、抗氧化等生物活性。 色体损伤，评价6．姜酚的遗传毒性。为探讨其可能的遗传毒性机制，用免疫组化 方法检测细胞内8．羟基脱氧鸟苷f8．OHdG)的表达水平，用2’，7’．二氢二氯荧光 甘肽(GSr0水平，用吖啶橙(Acridineorange)和罗丹明(Rhodamine19_3)分别测定 细胞内溶酶体膜稳定性和线粒体膜电位的改变水平。结果显示，6．姜酚(20pM．80 h后，引起DNA链断裂，细胞形成彗星样拖尾现象， “M)作用于HepG2细胞1 h后，可致细胞 且呈剂量依赖关系。6．姜酚(20“M．40“M)作用于HepG2细胞24 微核数量明显增加，并随6．姜酚浓度的增高而增加。此外，6．姜酚(20pM．80pM) h后，可致8-OHdG的表达升高；作用1h后，可引起细胞内 作用于HepG2细胞3 ROS水平增加、GSH水平下降；作用40分钟后，引起细胞内溶酶体膜稳定性改 变；作用50分钟后，引起细胞内线粒体膜电位下降。以上结果说明，6．姜酚对HepG2 细胞有遗传毒性作用，其机制可能与氧化应激有关，同时，溶酶体和线粒体可能 是6．姜酚造成HepG2细胞毒性的靶器官。 上述的实验结果显示，低剂量的6．姜酚不会引起细胞的氧化性损伤，提示低 剂量的6．姜酚可能具有文献报道的抗氧化作用，因此我们对低剂量的6一姜酚是否 具有氧化作用做了进一步研究。棒曲霉素(patulin，PAT)是由青霉菌、曲霉菌等产 生的真菌毒素。普遍存在于果蔬制品尤其在苹果中，在其它食品中也有发现。PAT 超标是果汁生产中的一个重大问题，是近年国内外引起重视的生物性食品危害因 素之一。世界卫生组织和世界上许多国家将苹果汁中PAT的最高允许浓度定为50 forResearchon Agency 证据尚不能就其对人类致癌性进行分类。我们在明确了PAT对HepG2细胞具有 氧化损伤及遗传毒性的基础上，采用6．姜酚为保护剂，观察低剂量6．姜酚的抗氧 化作用。结果显示，10pM的6．姜酚能显著降低PAT所致的DNA链断裂程度， 减少PAT诱发的细胞微核形成率。同时，6．姜酚抑制了PAT引起的ROS的生成， 同时升高了GSH的水平，并使8-OHdG的水平有所下降。结果证实，6．姜酚对PAT 造成的遗传毒性作用有很好的保护作用，其机制主要与6．姜酚具有的抗氧化活性 有关。 关于6．姜酚抗肿瘤的作用机制尚不十分清楚，其中诱导肿瘤细胞凋亡是其抗 肿瘤作用的主要机制之一。在研究6．姜酚遗传毒性时，我们发现溶酶体和线粒体可 能是6一姜酚造成HepG2细胞毒性的靶器官，因此我们推测6．姜酚诱发HepG2细胞凋 亡是否与溶酶体．线粒体这个途径有关。实验中，我们采用Hoechst33342荧光染色 dUTP．biotinnickend 和TUNEL(TdT-mediated labeling)方法，对6．姜酚所致的 Hcp02细胞凋亡进行了分析。用荧光法检测溶酶体通透性和线粒体的膜电位水平， 以及ROS和GSH的生成水平。用Western