根癌农杆菌介导高效大豆遗传转化体系建立.pdfVIP

第40卷第3期 分子细胞生物学报 V01．40．No．3 2007年6月 2007 ofMolecularCeU June Journal Biology 根癌农杆菌介导的高效大豆遗传转化体系的建立 党尉，·：卫志明p (1中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海200032；2中国科学院研究生院，北京100049) 摘要利用根癌农杆菌对来自大豆成熟种子的胚尖进行遗传转化，研究了影响农杆菌介导大豆转化 的各种因素，建立了一套优化的大豆遗传转化体系。研究结果表明：菌株KYRTl比EHAl05和 LBA4404具有更强的侵染能力；较酸的共培养基(pH5．4)、较低的培养温度(22℃)均有利于提高转化 效率：恢复培养和分步抗性筛选方式有利于提高抗性组织的存活率和分化率。同时应用这种优化的遗 证明外源的双价抗虫基因c删(c)和p玩已经整合到大豆的基因组中。 关键词：大豆根癌农杆菌胚尖优化抗虫 对一些影响大豆转化效率的因素进行了探讨。在建 大豆[GfyciMm泓(L)Merr]是一种重要粮 食、油料和饲料作物，是植物蛋白的主要来源，在国 立优化的转化体系基础上，用含有c喇(c)和p妃 内外市场上占有十分重要的地位。转基因大豆的研 (只凡e耽口把n越o 究也因此受到普遍重视。农杆菌作为一种自然的植 大豆进行遗传转化。 物基因转化系统，具有操作方便、费用低廉、可插人 1材料和方法 外源基因片段大、不易发生重排、拷贝数低且符合 孟德尔遗传规律等优点c1]，因而备受科研工作者的 1．1植物材料 重视。 大豆[G机ine 农杆菌成功转化大豆的首例报道是由Hinchee 等[z]在1988年所作的，之后的农杆菌转化大豆方面和黑农40。取表面光滑无病斑的大豆成熟种子，放 的报道大多以Hinchee的工作为基础。Meurer等[，] 报道了农杆菌转化大豆子叶节的影响因素，发现用 密闭容器中[m]，6—8h后取出放至无菌水中28℃浸 超声处理过的子叶节较对照容易转化，而且农杆菌 泡24h。去掉种皮，将下胚轴连同刚萌动的胚尖与 菌株KYRTl的转化效果最佳。最近也相继有报道两片子叶剥离，去掉原叶。 KYRTl在介导大豆转化方面可以明显提高转化效1．2菌株和质粒 率[。，引。Olhoft掣e，，]相继报道了在培养基中添加硫醇 本研究中用到的农杆菌菌株为琥珀碱型的 类化合物和L一半胱氨酸可以防止由农杆菌侵染而 导致的组织坏死现象，从而提高转化频率，同时采 用潮霉素作为筛选剂应用于农杆菌介导大豆的遗 传转化，也获得了很好的效果。我们实验室以卡那 由上海交通大学武天龙教授惠赠。农杆菌转化体系 霉素为筛选剂，采用EHAl05建立的胚尖转化体系 也获得了较高的转化频率[s|。Paz等[。塌：近建立了一 该质粒带有C洲y35S启动的B一葡萄糖苷酶(拶) 种“半种(half—seed)”系统使得大豆的转化简单化，基因(带内含子)和C洲y35S启动的除草剂抗性 而且转化效率有了明显的提高。从以上的报告可以 看出目前农杆菌转化法采用的受体系统多数为子 叶节。本研究采用大豆成熟种子胚尖作为转基因受 体，采用农杆菌介导转化法获得了转基因植株，并 +通讯作者，E—mail：zmwei@sippe．ac．cn 万方数据 万方数据 万方数据 188 党尉卫志明 目是EHAl05的1．4倍左右。因而在随后的实验中，测其GuS瞬时表达及相应的抗