骨架修饰及面展示技术用于功能核酸的优化及筛选.pdfVIP

摘要 摘 要 Nucleic 功能核酸(FunctionalAcids)由于具有丰富的多样性和良好的生物 功能，已作为一种常见的分子工具广泛应用于化学、生物学、生物医药科学以及 纳米技术等研究领域。通过策略性的化学修饰，功能核酸能够极大地满足各种典 型的实验需求并投入到更广泛的实际应用中。同时，发展更加经济、高效的 Evolutionof Enrichment)技术将为体 SELEX(SystematicLigandsbyExponential 外人工完成功能核酸的筛选与进化提供强有力的保证。 modification) 基于以上两方面，本论文从功能核酸的骨架修饰(Backbone 与筛选技术创新两个角度展开研究。 ～、利用骨架修饰提高G．四聚体DNAzyme的催化活性。 本文在第二章以G．四聚体过氧化物模拟脱氧核酶(Peroxidase Mimicking 修饰以及锁核酸修饰)对G．四聚体DNAzyme的过氧化物酶催化活性、结构、 有催化底物显色或化学发光的功能，近年来在生物医学研究及检测领域显示独特 的应用优势。因此，找到更加稳定、催化活性更高的G一四聚体DNAzyme无疑 具有重大的意义。本文的研究结果表明，骨架修饰会影响G．四聚体DNAzyme 的拓扑结构，进而改变其催化活性。更重要的是，本研究发现2’．氧．甲基修饰能 够起到促进平行G．四聚体结构形成的作用，并且极大地提高G．四聚体DNAzyme 的过氧化物酶催化活性和热稳定性，该发现为今后开发高稳定性、高活性的人工 过氧化物模拟核酸酶提供展新的思路。 二、BEAMing表面展示技术用于核酸适配体的筛选。 本文在第三章建立了以BEAMing表面展示技术为基础的核酸适配体筛选 EvolutionofLigandsbyExponential 新方法。传统的SELEX(Systematic Enrichment)技术需要经过漫长的8—20轮的筛选才可获得核酸适配体，筛选操作 Chain 冗长费力，同时后续克隆测序也繁琐复杂。另外，常规的PCR(Polymerase bias)和非特异性扩增条带，严重干扰 Reaction)过程容易产生扩增歧视(PCR 摘要 筛选的顺利进行。基于液滴PCR(Emulsion 无扩增歧视等优点，而且能通过将每个液滴中的PCR产物回收在相应的微球表 面上，使每条核酸序列的结构与功能特性独立显现，从而实现核酸序列的单克隆 展示。本章建立的方法利用偶联有PCR正向引物的琼脂糖微珠在油包水液滴中 PCR，使寡核苷酸库以单克隆的形式展示在微 进行单分子模板水平的BEAMing CellAdhesion 球表面，并通过核酸展示微球与过表达EpCAM蛋白(Epithelial Molecule，上皮细胞粘附因子)的人胃癌细胞KATOIII的亲和作用，成功获得 能够高亲和力结合EpCAM蛋白的核酸适配体，该法能够避免传统筛选方法中对 富集寡核苷酸库进行繁琐的克隆测序步骤。该BEAMing表面展示技术为今后更 加准确、高效、经济地获得功能核酸开辟了捷径。 关键词G-四聚体脱氧核酶，骨架修饰，BEAMing，表面展示，SELEX II Abstract Abstract Functionalnucle