GalNAc-14多抗的制备、组织表达及与IGFBP-3共定位研究.pdf

摘 要 摘 要 N- 乙酰氨基半乳糖转移酶家族是粘蛋白 O- 糖基化的起始酶，负责将供体 UDP-GalNAc 上的 GalNAc 基团转移至受体蛋白多肽链特定序列中的 Ser 或 Thr 羟基上， 从而合成 O-聚糖。近年来有人指出，O-糖基化可能与肿瘤的发生发展具有密切关系， 因此对该酶家族的研究也受到越来越多重视。N- 乙酰氨基半乳糖转移酶-14 （GalNAc-T14 ）是该家族中截止至目前最新发现的成员，由于其发现相对较晚，且对其 研究尚未得以广泛重视，因此对 GalNAc-T14 在癌组织和癌细胞中的表达、生物学特征 及功能之间的关系都需要深入研究。 本论文对 GalNAc-T14 基因进行了以下三方面的研究： 1．利用生物信息学方法分析 GalNAc-T14 蛋白序列，钓取了其 cDNA 序列，将该 序列亚克隆入 pET-DsbA 与 His-tag 融合表达；并且对诱导及纯化条件进行了优化。通 过免疫新西兰大耳白兔，获得多抗血清。利用双向免疫扩散检测所制备的多抗效价，通 过免疫印迹方法鉴定多抗特异性，并检测 GalNAc-T14 在不同组织的表达情况。结果表 明：制备的 GalNAc-T14 多克隆抗血清是高特异性的，GalNAc-T14 蛋白在乳腺癌细胞 和肾癌细胞中均有表达，并推测如果在肿瘤组织中发现低表达 GalNAc-T14 则可能显示 肿瘤恶性程度较高，与肿瘤易发生转移，预后差密切相关。 2 ．将GalNAc-T14 和 IGFBP-3 共转染 MCF-7 细胞，利用 confocal 显微镜观察两者 的共定位情况。结果表明：GalNAc-T14 和 IGFBP-3 在细胞内存在共定位现象。 3 ．成功构建了GalNAc-T14 昆虫细胞重组表达载体。将GalNAc-T14 cDNA 序列亚 克隆入 pMT/BIP/V5-HIS C 载体，转染果蝇 S2 细胞系，为将来利用昆虫表达系统获得 GalNAc-T14 蛋白，为深入研究 GalNAc-T14 的功能奠定基础。 总之，本论文对于 GalNAc-T14 功能进行了初步的研究和探讨，将 GalNAc-T14 与 IGFBP-3 进行亚细胞定位，并欲利用昆虫表达系统获得有活性的 GalNAc-T14 蛋白，为 下一步开展工作提供了材料和依据。 关键词 GalNAc-T14 多克隆抗体 组织表达分析 IGFBP-3 共定位 I Abstract Abstract The initiation step of mucin-type O-glycosylation is controlled by a large family of homologous N-acetylgalactosaminyltransferases which transfer GalNAc to serine and threonine acceptor sites. Recent studies demonstrate that O-glycosylation may be closely related to the carcinogenesis and development of tumours. Hence, Studys on the N-acetylgalactosaminyltransferases family are getting more and more attention. Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferases 14