HKaD5来源多肽与TRAIL的融合表达及生物学活性的研究.pdf

摘 要 20世纪70年代，Folkman首先提出 “肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的 生成”的论点。新生血管的形成是通过内皮细胞的增殖和迁移，从已有的毛细血 管周围生成新的毛细血管的过程，其可发生在胚胎发育时期、子宫内膜周期性变 化、损伤后修复和肿瘤生长等方面。血管新生主要受一系列促血管形成因子和抑 制血管形成因子的双重调控，一旦这些调控因子的平衡被打破，就可能导致不正 常的血管新生，引起肿瘤的生长和侵袭、心肌梗塞和糖尿病等疾病。目前已经证 实：原发性肿瘤的生长及侵入其他周围组织器官都需要新生血管提供其营养支持， 如果没有新生血管提供这些充足营养，一个肿瘤病灶在尺寸上不可能超过几毫米。 因此，如果抑制肿瘤组织内新生血管的形成，肿瘤细胞将发生凋亡或坏死，从而 抑制肿瘤的生长和转移，这就为抗肿瘤的治疗提供了一条新思路。 目前，在已经发现的内源性血管形成抑制因子中，单链的高分子量激肽原 （high molecular weight kininogen ，HK ）是血浆中一种多功能的糖蛋白，与血液 凝固、补体反应及炎症发生等密切相关。在结构上，HK 由六个结构域组成，其 中D1 、D2 和D3 区组成它的重链；D5 和D6 区组成它的轻链；重链和轻链之间 是由包含有一个九肽的缓激肽的D4 区相连。在血浆的激肽释放酶的作用下，单 链的HK释放出含D4 区的缓激肽后就形成了双链的HK 即活化型高分子量激肽原 （cleaved high molecular weight kininogen ， HKa ）。HKa 由含D1 、D2 、D3 的重 链和含D5 、D6 的轻链组成，重链和轻链之间由一个单独的二硫键连接。HK活化 为HKa的过程中，产生了较大的构象变化，从而使其第五结构域（D5 ）暴露的更加 明显，研究已发现：HKa轻链富含组氨酸区域 （histidine-rich domain,HRD ），即D5 区是HKa抗细胞伸展的活性区域，也是HKa抑制血管生成的活性区域。GUO等发 现HKa和D5 区通过裂解与内皮细胞膜上尿激酶型纤溶酶原活化物受体(μPAR)结 合启动的信号通路，从而使活化的内皮细胞去黏附而诱导内皮细胞凋亡来抑制血 管的新生，因此，HKa 的第五结构域（HKD5 ）具有潜在的抗肿瘤活性。近年来 在对HKD5 区发挥抑制活性的核心氨基酸序列的研究中，Zhang将D5 区的 384-503 位氨基酸片段合成了 14 个多肽片段，每段多肽片段都是由16 个氨基酸 组成，结果发现：多肽HKD5 480-495、HKD5 488-503 对内皮细胞的增殖抑制作用最为 显著。 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL ），又称凋亡素2 配体 （apoptotin-2 ligand ，Apo-2L ）是肿瘤坏死 因子（tumor necrosis factor ，TNF ）超家族成员之一，可形成编码的蛋白质TRAIL 由281 个氨基酸组成。TRAIL 能选择性诱导肿瘤细胞凋亡，但对正常组织细胞 无明显损伤。其N-端第114-281 位氨基酸片段是其核心序列，发挥TRAIL 的主 要功能，并可形成游离的可溶性蛋白。 通过动物实验显示：单纯使用HKa 或TRAIL 抗肿瘤会存在用药剂量较大、 起效时间长等问题，因此，本课题将以抑制肿瘤血管生长的HKD5 发挥活性的 多肽片段和诱导肿瘤细胞凋亡的TRAIL 的活性片段进行融合，得到具有双功能 作用的融合蛋白，即特异性的杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤组织内新生血管，从而提 高其抗肿瘤活性。 本课题运用基因工程技术，以编码一个甘氨酸的核酸序列作为连接臂，将 HKD5480-495、HKD5488-503 多肽的编码序列与TRAIL 114-281 编码序列融合，克隆表达 得到重组蛋白MBP-HKD5480-495-TRAIL114-281和MBP-HKD5488-503-TRAIL114-281 ，并将 得到的这两个融合蛋白进行生物学活性鉴定，发现MBP-HKD5480-495 -TRAIL 114-281 具有更强的杀伤肿瘤细胞和抑制内皮细胞增殖和迁移的作用，在此基础上对HKa D5区抑制肿瘤细胞的分子机制进行初步探讨。 一、 HKD5480-495 －TRAIL114-281 、HKD5488-50