NK细胞活化性体NKp30的表达与功能研究.pdf

摘要 摘要 固有免疫(innate immunity)是生物体在物种进化过程巾形成的··系列防御 机制，能迅速的对侵入的病原体产生非特异性抗感染免疫应答，同时固有免疫在 适应性免疫应答过程中也起着重要作用。天然杀伤细胞(naturalkillercells．NK) 是固有免疫系统的重要组成部分，在机体防御病原微生物感染和抗肿瘤方面发挥 着重要的作用。NK细胞的活化受其表面活化性与抑制性受体的协同调控，自然 细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptors，NCRs)是NK细胞特有的活化性受体， 通常在NK细胞表面抑制性受体丧失识别“自我”能力时，发挥杀伤作用。 活化以及杀伤肿痛的过程中发挥重要作用，近几年研究表明，NKp30分子参与 NK细胞与树突状细胞(dendritic O年里得到了研究者广泛的 免疫和适应性免疫的调控。NKp30分子的功能在过去l 关注，但NKp30分子在NK细胞的活化及免疫突触形成中的确切作用机制尚不清 楚。本研究中，我们构建了人NKp30胞外段结构域原核细胞表达载体，狱得有生 物学活性的NKp30重组蛋白。我们采用NKp30重组蛋白免疫小鼠，制备了抗 NKp30的单克隆抗体。我们利用免疫荧光、51Cr同位素释放实验、流式细胞术 (FACS)和免疫印迹(Western 细胞免疫突触形成中的作用进行了研究。 。 主要取得了以下结果： 1，NKp30分子胞外段结构域蛋白的表达与纯化 构建NKp30胞外段结构域蛋白的原核细胞重组表达载体，通过诱导表达，重 组蛋白以包涵体形式存在，经过Western blotting和质谱鉴定，目的蛋白为人NKp30 重组蛋白(简称rhNKp30)。分别采用稀释复性法和镍柱亲和层析法对rhNKp30进 胞的杀伤。结果提乃÷rhNKp30具有生物学活性，可用于功能研究。 2，抗人NKp30单克隆抗体的制备、鉴定及应用 用rhNKp30免疫8．10周龄的BALB／c雌性小鼠，采取不同的免疫策略，经过5 次免疫后，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤SP2／0细胞在聚乙二醇作用’卜．进行体外融 合。通过有限稀释法和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞株， 共狭得T4株能稳定分泌抗rhNKp30的单克隆抗体杂交瘤细胞株。我们选择了其 中对NKp30亲和力高的克隆号为3G5的单克隆抗体进行了深入研究。常规方法制 摘要 备腹水，经ProteinG亲和层析法纯化获得纯度为95％的单克降抗体3G5，并对该 抗体进行了特性鉴定和应用检测。单克隆抗体3G5能广泛用于Western blotting、 彳i影UI甸NKp30受体与其配体的结合。 3，NKp30分子参与NK细胞活化及免疫突触形成 通过副Cr同位素释放实验检；狭lJNK细胞对靶细胞的杀伤，实验结果表明抗 NKp30阻断抗体(克隆号：P30．15)能够明显抑制外周血NK细胞或者NK细胞系 NK92细胞对多种靶细胞的杀伤。通过筛选发现NKp30分子在外周血NK细胞或者 NK92细胞杀伤Hela细胞中发挥着丰导作用。为此我们采用NK92细胞作为效应细 胞，Hela细胞作为靶细胞进行免疫突触的研究。采用不l剐荧光标记的抗体的 细胞的接触面卜，提示NKp30分子参与NK细胞免疫突触的形成。通过FACS和免 疫荧光检测NK92细胞与Hela细胞的结合显示，在0．15min内，NK92细胞矛l：lHela 细胞的结合率与孵育时间成正相关，在15min达到最大结合率，15．30min效靶细 胞结合率变化不大。抗NKp30阻断抗体不能抑制效靶细胞的结合，提示NKp30 分予不影响NK细胞与靶细胞结合。FACS检测发现，Hela细胞能刺激NK92细胞 细胞毒脱颗粒的产生，抗NKp30阻断抗体能显著抑制该效应，提示NKp30分子在 NK细胞脱颗粒效应中可能发挥着重要的作用。ELIS