内切β--1,--葡聚糖酶基因在黑曲霉中的同源表达.pdf

中文摘要…………………………………………………………………………………………I 英文摘要………………………………………………………………………………………．．III 1弓I言…………………………………………………………………………………………………………………………．1 1．1研究目的与意义…………………………………………………………………………．．1 1．2文献综述…………………………………………………………………………………2 1．2．1纤维素………………………………………………………………………………．．2 1．2．2纤维素酶………………………………………………………………………………3 1．2．3纤维低聚糖……………………………………………………………………………4 1．2．4重组内切葡聚糖酶研究进展…………………………………………………………5 1．2．5内切葡聚糖酶应用……………………………………………………………………7 1．3本论文的主要研究内容…………………………………………………………………．8 2材料与方法…………………………………………………………………………………．10 2．1实验材料………………………………………………………………………………．．10 2．1．1菌种与载体…………………………………………………………………………．10 2．1．2酶和主要试剂………………………………………………………………………．10 2．1．3常用试剂的配制……………………………………………………………………．10 2．1．4培养基………………………………………………………………………………12 2．2实验方法………………………………………………………………………………．．12 2．2．1黑曲霉基因组DNA的提取…………………………………………………………12 2．2．2基因克隆……………………………………………………………………………．13 2．2．3根癌农杆菌介导的黑曲霉的遗传转化………………………………………………16 2．2．4同源重组菌株中潮霉素抗性基因的消除……………………………………………17 2．2．5内切葡聚糖酶酶活测定……………………………………………………………。17 2．2．6重组菌株分泌蛋白检测……………………………………………………………．．18 2．2．7重组菌株酶学性质分析……………………………………………………………。18 3结果与分析…………………………………………………………………………………．20 3．1内切葡聚糖酶基因engl的构建………………………………………………………．．20 3．1．1黑曲霉基因组的提取………………………………………………………………．．20 3．1．2内切葡聚糖酶engl基因的克隆……………………………………………………．20 3．2农杆菌介导法对黑曲霉的遗传转化……………………………………………………23 3．2．1采用冻融法转化农杆菌………………………．．．……………………………………23 3．2．2农杆菌转化子与黑曲霉的共培养…………………………………………………。23 3．2．3黑曲霉转化子的筛选和鉴定………………………………………………………．．24 I 东北农业大学理学硕士学位论文 3．3黑曲霉同源重组转化子的筛选与鉴定…………………………………………………．．25 3．4内切葡聚糖酶在重组菌株的表达………………………………………………………26 3．4．1内切葡聚糖酶酶活性测定…………………………………………………………．．26 3．4．2内切葡聚糖酶在重组菌株中表达分析………………………………………………26 3．4．3内切葡聚糖酶在重组菌株中酶学性质分析…………………………………………27 4讨论………………………………………………………………………………………………………………………．．29 5结论………………………………………………………………………………………………………………………．．30 5．1内切葡聚糖酶基因的克隆………………………………………………：………………30 5．3黑曲