利用BiFC技研究拟南芥GPX3和RRTF1与DOS1体内相互作用.pdf

摘 要 逆境胁迫可以分为非生物胁迫与生物胁迫两大类，严重影响着植物的正常生长发 育，其中许多非生物胁迫都可以诱导植物体内产生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，因此ROS 可能是各种胁迫信号的交叉点。近年来，科学家们通过DNA 微阵列技术分析了植物体内大量受 ROS 调控的基因，对这些基因的功能进行了研究， 并得到了许多在ROS 信号转导中起重要作用的基因元件。 实验室前期的研究发现，拟南芥GPX 家族中的GPX3(Glutathione peroxidase 3)编码 一个双功能蛋白，不仅能够清除植株体内过量的 H O ，而且可以直接或间接调节上游 2 2 氧化信号，传递和激活下游信号分子；AtDOS1(Drought overly sensitive 1)则是通过酵母 双杂交实验证实的能与GPX3 发生强烈体外互作的蛋白因子，DOS1 定位于细胞核中， 具有核定位信号(NLS)和保守序列WWE domain(Trp-Trp-Glu) ，在植物应答干旱和氧化胁 迫中发挥重要作用。进一步的研究表明，DOS1 可能为植物氧化胁迫信号转导途径中一 个重要的转录调节因子，并且在H O 胁迫下，DOS1 会从细胞核向细胞质跨膜扩散，从 2 2 而参与胁迫信号的传递。AtRRTF1 (ROS related transcription factor 1)则是另一个通过芯片 分析得到的可能与AtDOS1 存在相互作用的基因，该基因编码带有锌指结构的转录因子， 其表达受 H O 诱导，在生物及非生物胁迫信号转导中起中心作用。酵母双杂交实验也 2 2 显示RRTF1 和DOS1 之间存在体外相互作用。但目前我们仍然缺少GPX3 与DOS1 以 及RRTF1 与DOS1 之间存在体内互作的证据，并且对于DOS1 在氧化胁迫下的跨膜运 动及机理也不甚明了。 本论文通过双分子荧光互补实验(BiFC)研究了GPX3 与DOS1 之间以及RRTF1 与 DOS1 之间的体内互作关系，发现在野生型拟南芥叶肉细胞原生质体内，均能检测到这 两对蛋白之间发生相互作用的黄色荧光信号，说明GPX3 与DOS1 以及 RRTF1 与DOS1 都存在体内互作。进一步的DAPI 染色实验证明DOS1 与RRTF1 发生互作的部位在细胞 核内。在gpx3 突变体原生质体中，没有检测到较为明显的RRTF1 与DOS1 之间互作的 荧光，表明GPX3 可能影响DOS1 与RRTF1 之间的相互作用。为确定GPX3 与DOS1 以及RRTF1 与DOS1 之间的体内互作是否影响氧化胁迫下DOS1 的跨膜运动，从而影 响DOS1 传递胁迫信号，我们将实验室已有的DOS1 ::GFP 转化WT 植株(WT-DOS1 ::GFP) 分别和gpx3 ，rrtf1 T-DNA 插入纯合突变体进行杂交，筛选出带有DOS1-GFP 标签的gpx3 I 和rrtf1 突变体植株(gpx3-DOS1 ::GFP 和rrtf1-DOS1 ::GFP)，用激光共聚焦扫描电子显微 镜分别观察氧化胁迫下两种突变体中DOS1 的跨膜运动与WT 中的差异，经过统计分析 发现GPX3 对DOS1 的抗氧化胁迫运动有一定影响，在缺失GPX3 的情况下，更有利于 拟南芥下表皮条保卫细胞中的DOS1 在受到H O 和ABA 作用时发生从细胞核向细胞质 2 2 扩散的现象；而RRTF1 表达下调时，DOS1 的跨膜运动与正常情况相比没有明显的差别， 说明RRTF1 可能与DOS1 的扩散关系不大。 综上所述，GPX3 与DOS1 以及RRTF1 与DOS1 之间均存在体内互作，并且GPX3 在一定程度上影响DOS1 与RRTF1 的体内相互作用；同时，GPX3 与DOS1 之间的体内 互作可能影响DOS1 在氧化胁迫下的运动。 关键词：DOS1 ，GPX3 ，RRTF1 ，