未培养微生物β葡萄糖苷酶基因的新功能鉴定以及突变研究.pdfVIP

未培养微生物B一葡萄糖苷酶基因的新功能鉴定以及突变研究 摘 要 筛选得到的一个编码B一葡萄糖苷酶活性的新基因资源。前期已经构建得到 表达B一葡萄糖苷酶活性的重组菌株pGxAG801。该基因的生物信息学分析 表明：在氨基酸水平上，Bgl1D基因编码蛋白与已知来自肉毒杆菌脂肪酶蛋 白有31％的相似性，由此推测该B舀1D基因除具有编码p一葡萄糖苷酶活性 外，可能还具有编码脂肪酶活性的功能，其编码蛋白可能是一种兼职蛋白 质。在核苷酸水平上，BgllD与己知数据库中的脂肪酶基因相似性很低。 重组菌株pGl姒G801编码目的蛋白纯化后，以PNPB为底物，对其进 行了脂肪酶酶学性质的初步研究，得到以下结论：该蛋白的最适pH为9．O； 最适温度为250C；Km为O．54 下酶活为8．2 离子有抑制作用。验证了该基因编码蛋白除具有§一葡萄糖苷酶活性外， 同时还具备脂肪酶的活性。 利用易错PCR技术，以6∥，D基因为模板构建突变体库，筛选得到一 突变酶纯化后验证酶活，发现D．葡萄糖苷酶和脂肪酶活性均降低，其中1号 p．葡萄糖苷酶酶活为原始菌株的30％，脂肪酶为20％，测序表明该蛋白氨基酸 序列有3个位点发生突变，2号菌株p．葡萄糖苷酶酶活为原始菌株的20％， 脂肪酶酶活丧失。测序表明该蛋白氨基酸序列有6个位点氨基酸发生突变， 由此分析推测突变处可能为该酶保守区域。 基因州J『D编码蛋白除具有B一葡萄糖苷酶催化活性外，还有脂肪酶催 化功能，推测叫J『D基因有可能是一种新型编码脂肪酶的基因。通过突变 体文库构建说明保守氨基酸序列对酶活的重要性，为进一部阐明催化机理 打下坚实基础。 关键词：脂肪酶脂肪酶家族易错PCR突变体文库 EXPRESSIONANDENZYMATIC OF PROPERTIES NOVEL BIFUNTIONALGENESINUNCMITURED MICROoRGANISMS ABSTRACT lD accession number an bgl gene(Genb2mk FJ686869)is encoding p—glucosidase thenew resourceswhichcome丘．oma actiVi妙of genetic wasbeen t11at metagenomiclibra巧．It constmctedrecombinamstrains l whichcanshow pGXAG80 p-glucosidase i11dicatethat：Inthe锄inoacid Dshow31％ a11alysis leVel，Bgll simila打ties t0 f如mClostridium accordinglipaSe botulinum，which indic砷edmatt11e D haVe be may encoded Bgll lipaseactiVit)r．Theremay isa thenucleotide isno protein level，there moonli曲tingproteins．In whi