糖皮质激素通过控E6-p53-miR145信号通路影响宫颈癌耐药.pdfVIP

摘 要 研究背景 流行病学的研究证明慢性心理应激反应与宫颈癌的发生发展密切相关，但精确的分 子机制尚不清楚。工作压力、经济负担等因素可导致交感神经系统和下丘脑-垂体- 肾上 腺轴的兴奋，进而导致机体产生慢性应激反应。糖皮质激素是一类重要的应激反应激素。 最近的研究表明，长期处于慢性应激反应状态的人群其体内糖皮质激素的水平持续增 加。糖皮质激素的持续刺激不仅可以导致免疫系统的功能紊乱，还可以直接影响肿瘤的 生物学行为。 宫颈癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一。宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV) 感染密切相关。HPV 基因编码的E6 蛋白通过诱导宿主细胞p53 的降解从而引起细胞癌 变，是HPV 感染导致宫颈癌的主要机制之一。2007 年p53 被证实可以调控某些miRNA 的表达，这被认为是p53 实现效应功能的第三条重要途径。miR-145 的表达受p53 转录 依赖和转录非依赖的方式调控，且最新的研究表明，miR-145 在多种实体瘤中发挥抑癌 因子的功能。但miR-145 在宫颈癌中的生物学功能及病理生理条件下的表达调控机制均 不清楚。 目的 研究糖皮质激素调控相关信号通路诱导宫颈癌细胞恶性表型形成过程，在分子水平 上阐明慢性心理应激反应参与宫颈癌发生发展的精确机制。 方法 利用Real-time PCR 技术和免疫组化检测宫颈癌临床标本中miR-145 及IRS-1 的表 达，利用分子生物学技术钓取C33A 细胞中突变的p53 基因，构建含有突变p53 基因的 mp53 重组质粒，转化表达菌株JM109 感受态细胞，纯化提取表达质粒，通过SDS 和Western blot 方法验证p53 调控miR-145 及其下游靶基因的调控通路。利用分子生物 学技术克隆HeLa 细胞中E6 蛋白基因片段，构建含有E6 蛋白基因的E6-flag 重组质粒， 转化表达菌株JM109 感受态细胞，纯化提取表达质粒，利用糖皮质激素和化疗药物刺激 相关细胞，通过SDS和Western blot 方法验证糖皮质激素对E6 蛋白表达的影响， 以及E6 调控p53 的表达调控通路。并通过FACS 检测细胞周期和细胞凋亡进一步探讨 了miR-145 的细胞生物学意义。 I 结果 我们首先在宫颈癌临床样本中检测了miR-145 的表达，结果表明与癌旁组织相比， miR-145 在宫颈癌组织中的表达明显降低。为进一步探索miR-145 表达下调的机制，我 们在体外应用多种刺激物刺激宫颈癌细胞，检测miR-145 的表达变化。结果表明，糖皮 质激素的刺激可显著下调miR-145 的表达，同时我们还在全细胞裂解物中发现糖皮质激 素可下调p53 的表达。在随后的实验中，我们证明了在宫颈癌细胞中存在p53-miR-145 调控通路。我们在不同种类的宫颈癌细胞中过表达p53 ，均发现p53 的过表达可显著增 强miR-145 的表达并抑制miR-145 的靶基因IRS-1 的表达。免疫组化的研究结果表明， IRS-1 在宫颈癌临床样本中过表达，这与miR-145 的表达下调相符。此外，我们还证明 了在宫颈癌细胞中，只有功能性的p53 才能调控miR-145 的表达，而突变的p53 不具备 此功能。随后的实验中，我们进一步回答了糖皮质激素如何在宫颈癌细胞中下调p53 及 miR-145 的表达。结果表明，宫颈癌细胞表达糖皮质激素受体，且糖皮质激素可通过激 活其受体从而在转录水平和蛋白水平增强 HPV E6 的表达。E6 过表达可显著诱导 p53 降解及miR-145 表达下调，亦可抑制由化疗药物所诱导的p53 聚集及miR-145 表达上调。 反之，敲低E6 表达可增强化疗药物所诱导的p53 及miR-145 表达。功能实验的结果表 明，糖皮质激素作用于宫颈癌细胞可显著削弱化疗药物所诱导的细胞增殖抑制效应，其 机制可能为糖皮质激素明显抑制化疗药物诱导的细胞凋亡。同时，我们还发现糖皮质激 素可显著抑制由化疗药物所诱导的p53 及miR-145 表达上调。更为重要的是，在宫颈癌 细胞中过表达miR-145 可部分逆转由糖皮质激素所诱导的耐药表型形成。因此，我们认 为 miR-145 的表达下调可能在糖皮质激素所诱导的宫颈癌细胞化疗药物耐药中起重要 作用。 我们还进一步探索了m