《DNA琼脂糖凝胶电泳》.doc

DNA琼脂糖凝胶电泳 简介 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 实验材料 质粒DNA、基因组DNA或它们的酶切产物、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、上样缓冲液、TAE电泳缓冲液（Tris, NaAc, EDTA）。 实验原理 在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而能达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 四、实验步骤 称取1g琼脂糖，加入到100ml TAE中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至50-60oC时，加入4μl EB溶液，轻轻混匀。 待凝胶液冷至50oC左右时，倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。 在凝胶槽中放入梳子，注意调节好梳子之间的距离。 待凝胶成形后，小心拔出梳子，用刀片将凝胶与凝胶槽之间小心地分离，小心取出凝胶，放入盛有电泳缓冲液的电泳槽中。若电泳缓冲液不足，可加入适量电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面高出凝胶2~3mm。 用移液枪取5μl待测DNA样品，与上样缓冲液混合均匀，小心地加入到凝胶上样孔中。 打开电泳仪，插好导线，电压110V，电泳20min。也可根据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止。 电泳完成后切断电源，取出凝胶，置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。 五、注意事项 影响DN片段琼脂糖电泳的几个因素：（1）DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。（2）琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。 琼脂糖凝胶浓度 可分辨的线性DNA片段大小（kb） 0.4 5~60 0.7 0.8~10 1.0 0.4~6 1.5 0.2~4 1.75 0.2~3 2.0 0.1~3 （3）DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状DNA线状DNA单链开环DNA。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。（4）电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。 （5）嵌入染料的存在降低线性DNA迁移率，不提倡嵌入染料加在电泳液中 （6）电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）。 2. 溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3. 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色二甲苯晴携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 附：50×TAE电泳缓冲液贮存液配方：（50×）每升 242g Tris 57.1ml 冰醋酸 100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 几个相关化合物的结构式 Tris EDTA EB 琼脂糖聚合物