动物源性食品中种动物源性肉及肉制品鉴别检验的研究.pdfVIP

||Ul l IIIIIIIIIIIIIIIllIIIIIl Y21 摘要 43869 近年来，动物源性食品掺假、过分添加各种添加剂、使用非食用性原料和成 分等各种食品安全问题不断出现。因此，建立快速、准确的检测方法，对食品进 行动物源性成分鉴定已经成为一个备受关注的问题。本试验开展了多重PCR技术 鉴别检测肉食品中动物源性成分的研究，通过分子生物学手段，研究各类动物源 性肉及肉制品的特异性基因，借助聚合酶链式反应的特性，来达到对相应的动物 源性肉及肉制品定性和定量检测的目的。 用Ⅺ法、氯仿．醋酸钠法、酚仿抽提法、试剂盒法和FTA滤膜法5种提取方 法分别对新鲜动物组织进行基因组DNA提取，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，所 获基因组DNA均呈现亮带，背景清晰，电泳条带整齐均匀，完整性好。用同等样 品，Ⅺ法和氯仿-NaAe法提取效果最好，试剂盒法次之。紫外分光光度计所测 OD260nm／OD280nm值在1．70~1．93，浓度为0．1~2．0 u∥此，提取的DNA无RNA 和蛋白质或酚的污染。 DNA聚合酶、dNTPs浓度、Mf+浓度、引物、循环参 试验过程中通过对Taq 数、反应温度、反应时间等参数的优化，确定了PCR的反应体系和反应程序。鸭 和猪(引物1)单重PCR反应体系为：预混液25此，引物终浓度为0．2Funol／L， rain； 模板O．5嵋，用ddH20补足体系50此。鸭成分PCR反应条件为：94℃预变性5 94℃变性30s，56oC退火40s，72℃延伸60s，35个循环；最后于72℃延伸5 min；94℃变性60s，54℃退火 min。猪成分PCR反应条件为：94℃预变性1 30 s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。鸭肉DNA扩增后在226 bp 位置有明亮条带，猪肉DNA扩增后在149 bp位置有明显亮带，与预期目的条带大 小一致，空白对照无条带产生，无非特异条带。Ⅺ法最低检出限为0．005％，氯仿 -NaAc法检出限为O．01％，试剂盒法检出限为0．1％． 鸭和猪(引物1)双重PCR反应体系为：预混液25IlL，鸭引物各2此，猪1引 物各0．5 s， 足体系50“L。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火40 72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸7min。结果可同时扩增出两个清晰条带， 位置与目的条带一致。 用牛、山羊、绵羊、猪、鸡、马、鹿、兔8种动物相应的特异性引物进行多 重PCR扩增，从不同物种扩增得到片段大小各不相同的PCR产物。PCR反应体系 为：预混液25此，混合引物6．5 IlL，模板0．5嵋，用ddH20补足体系至50此。 反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃左右退火30s，72℃延 伸30 s，35个循环；72oC延伸4 min。经过反复试验，当引物的混合比例为通用 上游：牛：山羊：绵羊：猪2：鸡：马：鹿：兔=1：2：3：O．5：1：0．6：2：1．5： 1．8(1代表20 pmol／50“L)时，扩增效果最为理想。此方法能同时扩增出8种动物的 特异性条带，检测灵敏度达到0．01％