布鲁氏菌疫苗株产相关因子Omp25蛋白与宿主胚胎滋养细胞相互作用的研究.pdfVIP

布鲁氏菌疫苗株流产相关因子Omp25 蛋白与宿主胚胎滋养细胞相互作用的研究 中 文 摘 要 布鲁氏菌病（brucellosis ）(以下简称布病)是由布鲁氏菌（brucella ）引起的人、畜 共患传染病，广泛分布于世界各地。布鲁氏菌病对我国经济建设、人民健康生活、国家 安全等存在着严重的威胁。 布病的病原为布鲁氏菌，是一种胞内寄生菌。它的致病机制以胞内生存为主要特征。 研究表明，动物胎盘是布鲁氏菌生存、繁殖的嗜好区域之一。胚胎滋养层细胞是布鲁氏 菌感染的靶细胞，一旦被破坏，容易引起流产，但是其分子机制目前还不清楚。因此， 以布鲁氏菌和胚胎滋养层细胞为研究对象具有重要意义。本研究主要包括以下几方面内 容： ⑴．流产布鲁氏菌 S19 omp25 基因Bait 载体的构建及鉴定。通过对流产布鲁氏菌 S19 omp25 基因进行克隆、连接、酶切、纯化等实验，构建重组质粒 pGBKT7-omp25 并将其转化到酿酒酵母Y187 中，通过酵母自激活实验和毒性实验检测转化子酿酒酵母 Y187 （pGBKT7-omp25 ）的构建。经 PCR、酶切、测序表明成功构建了 pGBKT7-omp25 真核表达载体，获得的转化子酵母Y187 菌株无自激活活性，无毒性。 ⑵．流产布鲁氏菌S19 侵染TGC 细胞后提取总RNA 构建cDNA 文库。 首先用布 鲁氏菌S19 侵染牛胚胎滋养层细胞（TGC ）3.5h 后提取Total RNA,用试剂盒逆转录形成 cDNA, 采用同源重组技术构建布鲁氏菌 S19 侵染 TGC 细胞的 cDNA 文库，即 6 pGADT7-cDNA 并将其转化到酿酒酵母AH109 中，经鉴定，cDNA 文库库容为1.30×10 ， 重组效率为96.0%，插入片段大小在0.2-2.0kb 之间。 ⑶．酵母双杂交实验。应用酵母双杂交技术，将酿酒酵母AH109 （pGADT7-cDNA ） 和Y187 （pGBKT7-omp25 ）进行杂交并将阳性杂交子进行摇菌、提质粒、转化DH5α、 PCR 等实验鉴定。最后送交测序并对测序结果进行分析。测序结果表明，筛选出与流产 布鲁氏菌流产相关因子Omp25 相互作用的TGC 细胞的靶蛋白共16 个。 ⑷．Q-RT-PCR 实验。 通过上述实验获得 16 个蛋白基因序列，对其中2 个基因设 计引物，检测两种特异结合蛋白的 mRNA 的增减规律，进一步分析与 S19、RB51 的 Omp25 蛋白相互作用的滋养层细胞靶蛋白。结果表明RB51 侵染TGC 细胞后，TMED1 和clusterin 基因的量均增加，而S19 侵染TGC 细胞后，TMED1 基因增加，clusterin 基 因的量降低。 以上实验结果证明，成功地构建了流产布鲁氏菌S19 omp25 基因Bait 载体；成功构 建了流产布鲁氏菌S19 侵染TGC 细胞的cDNA 文库；酵母双杂交筛选出流产布鲁氏菌 OMP25 蛋白与TGC 细胞相互作用的16 个蛋白，并对TMED1 基因和clusterin 基因进行 Q-RT-PCR 分析。通过本实验，为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定 基础。 关键词：流产布鲁氏菌；Omp25 ；外膜蛋白；酵母双杂交；cDNA 文库 - 8 - 布鲁氏菌疫苗株流产相关因子Omp25 蛋白与宿主胚胎滋养细胞相互作用的研究 Abstract Brucellosis, which is a zoonosis chronic infection disease caused by Brucella, has occuerd widly in the world. Brucellosis is a severe threaten the economy construction, public health and