毕赤酵母表达系糖基化修饰改造研究.pdfVIP

中文摘要 中文摘要 随着蛋白质药物需求量的递增，酵母表达系统逐渐引起人们的关注。基因工 程的快速发展，使酵母的人源化改造成为可能。本实验室前期已经通过二次同源 重组技术成功敲除毕赤酵母的0L．1，6．甘露糖转移酶(OCHlp)基因，阻断了酵母的 I(OCH 高甘露糖基化途径，得到了过度糖基化缺陷株GJK0 I。)，然后把酿酒酵 母a．1，2．甘露糖苷酶(MnsI)基因内质网定位信号与来自拟南芥的cc．1，2．甘露 I，MDSI)基因融合，定点整合到毕赤酵母基因组 糖苷酶I(a．1，2-mannosidase 上，获得了能够合成哺乳动物Man5GlcNAc2复杂型甘露糖型的人源化糖基工程酵 母，部分实现了酵母的人源化改造，己用于蛋白质药物的表达。但是酵母表达系 统仍然存在一些缺陷，影响了它的推广，这其中就包括糖基工程酵母N．糖基化不 完全和过度O．糖基化的问题，我们对此开展了研究。 对于酵母N．糖基化修饰不完全的问题，我们采用导入外源N．糖基转移酶的 方式予以改善。利用尿嘧啶(URA3)营养缺陷型筛选标记，在酵母菌株4．32中 oxidase 转入醇氧化酶启动子(alcohol and 转移酶(stauroporinetemperature Blot amidaseF，PNGase 和N-糖肽酶(peptide-N-asparigineF)酶切等方法，分析其表达 factor 2)的N．糖基化程度。 的抗HER2抗体(anti．humanepidermalgrowthreceptor 达的商业化的抗体有相同的55x103左右的重链主带外，还有一条相对分子质量 约为50×103的条带。PNGase F酶切后，上述重链均呈50x103的均一条带，Western Blot分析证明这些条带均为抗体成分。则50x103的均一条带条带即为未糖基化 为均一的55x103条带，无未糖基化的50x103条带。用粒细胞．巨噬细胞集落刺激 因子(granulocyte-macrophagecolony—stimulatingfactor，GM—CSF)作为报告蛋白验 万方数据 毕赤酵母表达系统糖基化修饰改造研究 4．32．GM．CSF．STT3D工程菌表达的则为均一的22×103条带。PNGaseF酶切后， 两个N．糖基化位点，所以推测22x103是两个位点均发生了糖基化形成的条带， 20x103是仅一个位点发生糖基化形成的条带。 考虑到STT3D表达载体由AOXl甲醇诱导型启动子控制启动，所以我们分 别研究了STT3D基因非诱导和STT3D诱导时对酵母生长的影响。统计学分析显 的阴性对照菌4．32．HL(--STT3D)生长情况相比，旷O．0320．01，说明两者无显 两者差异性显著，提示STT3D诱导表达对酵母生长影响十分明显。 另一方面对于酵母过度O．糖基化修饰的问题，常规手段是采用敲除的方式阻 断基因表达，但是考虑到酵母O．糖基转移酶PMTs对酵母生长是不可或缺的，敲 除致死，拟采用可诱导的阻遏方式抑制该过程。根据参考文献报道的 导型启动子D6控制诱导表达，这样dcas9既保留了与靶位点特异性结合的能力， 又失去了核酸内切酶活性，还具有诱导控制PMTs基因启动的特点。为了让dcas9 阻遏蛋白进入细胞核发挥作用，我们采用了在dcas9基因的3’端融合核定位信号 (nuclearlocalization