拟南芥T1N622基因在抵抗灰葡萄孢侵染中的功能研究.pdfVIP

摘要 cinerea)引起的灰霉病是一种世界性的重要病害，常给农 由灰葡萄孢(Botrytis 业生产造成重大的经济损失。分离植物抗灰霉病相关基因，研究其抗病分子机制，进 而培育抗病新品种是防治灰霉病的有效途径。本实验室前期通过筛选拟南芥的T-DNA 插入突变体库获得了一株对灰葡萄孢敏感的突变体，利用TAIL．PCR技术和生物信息 学方法确定了突变体的突变基因为TIN622，推测丌胍22基因为拟南芥的抗灰霉病 相关基因。为进一步确定该基因的功能及其在抗病过程中的具体作用，本研究对 tln6 22突变体进行分子鉴定和抗病性测定，明确了tln622突变体对灰葡萄孢的敏感 性和对丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas DC3000，Pst syringaepv．tomato DC3000)的抗病性。通过互补回复试验，验证了T1N622基因为拟南芥抗灰葡萄孢相 关基因。利用RT-PCR和Real—TimePCR技术，确定了T1N622基因是通过水杨酸(SA) 和茉莉酸(JA)信号途径影响拟南芥对灰葡萄孢的抗性。利用黄色荧光蛋白YFP融合 蛋白技术，确定了T1N622蛋白定位于叶绿体。利用酵母双杂交技术筛选拟南芥cDNA 22的互作蛋白。为进一步阐明TIN622基因抗灰霉病的分子机制及 文库，获得T1N6 植物抗病育种奠定了良好基础。 1．对tln622突变体进行分子鉴定，确定了其纯合突变体为TIN622基因的功能 缺失突变体。检澳lJtln622突变体对灰葡萄孢的抗病性，发现tln622突变体表现为明 显的感病症状(野生型为抗病症状)；tln622突变体中灰葡萄融C腿因的表达水 平明显高于野生型：台盼蓝染色和DAB染色法确定tln622突变体叶片中死亡细胞数 22突变体对灰葡萄孢的敏 量和H202的积累量均明显高于野生型，进一步确定了tln6 感性。检i燹lJtln622突变体对A，DC3000的抗病性，发现Hn622突变体表现明显的抗 性(野生型感病)，采用间苯胺蓝染色法检测到fJ『行622突变体中胼胝质大量积累，进 一步验证了tln622突变体对风fDC3000的抗病性。 2．通过农杆菌介导法将构建好的TIN6 35S：：TIN6 22突变体中，抗生素筛选获得了TIN622基因 22(CDS)-NOS转化至tln6 的转基因回复株系；利用PCR和Southern 22基因以多拷贝 blotting鉴定，确定了T1N6 形式成功整合至：lJtln622突变体基因组中；利用RT-PCR技术分析，确定了转基因株系 中TIN622基因及抗病防御相关基因的表达恢复到了野生型水平；抗病性测定发现， 回复转基因株系恢复了对灰葡萄孢的抗病性和对nf DC3000的感病性，进一步确定 了TIN6 22基因为拟南芥抗灰霉病相关基因。 ACC、SA及JA处理后TIN622基因的表达情况进行分析，发现SA及其类似物BTH处 理后该基因的表达明显增强，JA处理该基因的表达明显减弱，ACC处理该基因的表 达没有明显变化，表明TIN6基因的表达受SA 22．失缺成合AJ将。制抑的AJ和导诱的 突变它qkjarl用JA处理，检测丌^陋22基因的表达情况，发现C01．0中TIN622在JA处理 22的表达受JA 后下调表达，而jarl突变体中刀肺22的表达没有明显变化，说明T1N6 22 测M刀的表达情况，发现各突变体中TIN622基因的表达明显减弱，说明TIN6