甲基营养菌Mehylobacterium sp.MB200与类胡萝卜素合成相关基因的克隆及研究.pdfVIP

ium sp．MB200 甲基营养菌Methylobaoter 与类胡萝I、素合成相关基因的克隆及研究 摘要 甲基营养菌被定为能够利用含一个或多个碳原子但不含C—C键的低碳 化合物(如甲醇、甲胺等)为唯一碳源和能源进行生长的一类微生物，利 用其特殊的代谢途径，可以进行单细胞蛋白、氨基酸、类胡萝卜素等的生 产，因此研究该类细菌的合成代谢途径无论从理论还是实际应用上都具有 显著的意义。 实验以甲基营养菌Msp．MB200为原始菌株，首先采用转座子突变技 术和三亲本接合方法构建了M 1552 sp．MB200的部分突变体库，库容量为1 株，通过表型颜色变化从部分突变体库中筛选得到33株颜色发生变化的目 的突变体，随后利用分子克隆技术对目的突变体的突变基因进行克隆，共 得到8个基因，分别对这8个基因进行了生物信息学分析，发现有三个基 因与类胡萝卜素合成途径密切相关，分别为GGPP合成酶基因、crtB基因 叶- 八氢番茄红素，CrtI的功能体现在八氢番茄红素的脱氢过程中，有两种选择， 第一种选择是催化八氢番茄红素经过四次脱氢合成红色的番茄红素，第二 种选择是催化八氢番茄红素经过三次脱氢合成黄色的链孢红素，因此在类 胡萝卜素生物合成途径的选择中扮演着重要的角色。鉴于CrtI的这种特殊 功能，本实验选择crtI基因作为进一步研究的对象，生物信息学分析发现， 从目的突变体MBW31中克隆得到的crt／基因，全长为1539 bp，编码512 个氨基酸，与来自Mpopuli CM4和M extorquens PAl、M chloromethanicum BJ00 extorquens CM4和M 1的CrtI在氨 populi 基酸水平上相似性均为96％。 定原始菌株与重组菌株的CrtI酶活，结果发现，重组菌株CrtI的酶活与原 始菌株相比约提高了42％。另外，通过对提取的类胡萝卜素进行分光光度 法检测和高效液相色谱法检测，发现其产物中并没有番茄红素的产生，由 此推测CrtI在M sp．MB200的类胡萝卜素合成途径中扮演的角色可能是催 化八氢番茄红素经过三次脱氢合成黄色的链孢红素，而不是催化八氢番茄 红素经过四次脱氢形成红色的番茄红素。实验结果为完善甲基营养菌中类 胡萝卜素的生物合成代谢途径提供了理论参考和依据。 关键词：甲基营养菌类胡萝卜素crtI八氢番茄红素重组菌 OFCAROTENOID ANDI冱SEARCH CLONING FROM RELATEDGENES BIOSYNTHESIS SP．MB200 METHYLoBAcTERIUM ABSTRACT can C bacteriaarea of