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人精子发生相关新基因的克隆、表达和功能研究 (中文摘要) 博士后：马用信 精予发生是一个复杂的细胞分化过程，涉及生精细胞的生长、分裂、分化和 信号传递等，导致一系列显著的分子和形态学变化。这一过程要求一系列基因表 达的精确调控，男性原发不育的遗传学研究发现了许多在性染色体和常染色体上 对于正常精子发生起重要作用的基因。Y染色体上的基因已经被系统研究，并分 离了两个无精症侯选基因家族：RNA deletedin bindingmotif(RBM)基因和Genes azoospermia(DAZ)基因。 此外，在人和鼠中，常染色体上的一些基因也报道与精子发生有关，包括 HSPA2等。除D．Page外，目前已报告的一些相关基因的研究大多基于动物实验， 未能为人类突变筛查所证实。国内外作者对Y和其它染色体上认为与精子发生 作者认为确实可能存在一些基因，其异常可以引发精子发生障碍或男性不育，为 此，国内外同行在寻找新的精子发生相关基因方面正做出不断的努力。 本文从克隆新的与精子发生相关基因入手，并对克隆的两个人的新基因及… 个鼠的同源基因做了初步的研究，结果如下： 1．运用同源比较和特异的RT-PCR法，作者从人睾丸组织中分离了人受精促进 AF536533。 2．与蛋白数据库比较后，发现为鼠编码受精促进肽的Tcpll基因的同源基因， 在氨基酸序列水平的同源性为78％。 3．运用荧光原位杂交(FISH)方法和生物信息学方法将TCPll基因定位于 6p21．2-3。 4．利用生物信息学方法确定了TCPll各转录本基因组的结构，与TCPlla相比， 在基因组的5，-端存在复杂的外显子剪接现象。 5． 利用Northern杂交方法仅在睾丸组织中检测到表达，而在其它组织中未检 测到杂交信号。 6． 用RT-PCR检测TCPll基因在不同类型睾丸组织的表达，发现仅正常成人 睾丸组织有表达，而无精症患者、胎儿组织均不表达。 7． 1蛋白的表达，其它生殖细 免疫组化分析仅在延长的精细胞中检测到TCPl 胞类型及支持细胞和间质细胞均未见TCPll蛋白的表达。 8． 根据TCPll基因的表达模式、同源性分析、鼠Tcpll基因及受精促进肽的 功能，可以认为：TCPll基因编码人受精促进肽的受体，并在受精过程中 可能具有重要作用。 9． 运用mRNA差异显示法，对2例正常成人和2例原发无精症患者的表达谱 进行了比较，愿到了36条差异明显的片段，对其中的12个进行了克隆和 测序分析，发现其中有6个片段(EST)Nf1％代表了尚未克隆的新基因。 并进行了克隆和序列分析。与mRNA差异显示所得到的3’端序列合并后， 获得了1个全长cDNA。它的长度为753bp，编码228个氨基酸。与蛋白 数据库比较后，发现它同时含有C3HC4和C2H2锌指结构域，并将这个新 基因命名为ZNF313，GenBank登录号为AF265215。 11．利用FISH方法将ZNF313定位于20q13。 12．利用Northern杂交方法，发现ZNF313有2．4kb和0．75kb2个转录本。O．75kb 的转录本在睾丸组织中高表达雨在其它组织中不表达或低表达。这提示该 基因可能在睾丸的精子发生过程中起作用。 转录本的序列，发现与O．75kb的转录本差异是：由于3’．非翻译区的选择 性的加尾信号的使用而导致了2个不同长度的37．非翻译区。但2个不同 转录本编码同一种蛋白。 14．利用生物信息学方法确定了ZNF313基因组内含子和外显子的大小。经分 析发现ZNF313基因由6个外显子组成。其基因组序列的长度为17486bp。 方法克隆了鼠的同源基因。后者长度为2．1kb，编码229个氨基酸，与蛋白 数据库比较后，发现它也同时含有C3HC4和C2H2锌指结构域。将该新基 2 因命名为Znf313，GenBank登录号为AF282919