荧光定量pcr技术讲座理论基础引物及探针设计体系优化实验方案数据分析污染防控.pptVIP

二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： 在Taqman探针法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，还要5’-3’外切酶 的活性来切断探针链产生荧光，普通PCR的延伸温度为72℃，此温度为Taq 酶聚合作用的最佳温度；Taqman探针法反应中，在要求Taq酶5’-3’聚合酶活 性的同时，还需要Taq酶5’-3’外切酶的活性来切断探针链产生荧光，Taq酶 5’-3’外切酶活性的最佳温度为60℃，所以Taqman PCR反应的一般采用两步 法，即95℃变性，60℃复性延伸。 在Taqman探针及引物的设计过程中，引物的TM值已经确定为60℃左 右，在每轮PCR循环的复性过程中（95→60℃），为了确保探针先于引物与 模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10℃左右，所以Taqman探针及引 物一般都是引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右。 二、引物及Taqman探针的设计 2、Taqman探针及引物的设计原则： （1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子； （3）、引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右； （4）、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G，因为5’G会有淬灭作用，而且即使 是被