细胞生物学自主实验方案确定版.docVIP

人的外周血淋巴细胞培养、染色体标本制备及染色体核型分析 09级3班 2组 【摘要】各种生物的染色体数目是恒定的。大多数高等动植物是二倍体，每一个体细胞含有两组同样的染色体。染色体是显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。通过本实验掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人外周血淋巴细胞进行核型分析。人外周血中的淋巴细胞几乎都在G1期或G0期是不分裂的。当在离体培养条件下加入植物凝血素（PHA），淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，使其恢复增殖能力，随后进入有丝分裂。 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞，从而进行核型分析。通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。该方法已为临床医学、病毒学、药理遗传毒理学等方面的广泛应用。 【关键词】染色体 有丝分裂 人外周血淋巴细胞培养 染色体制备 核型分析 1.实验原理 要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，供给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G 0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体观察分析的中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显从而更有利于辨认。每一个体细胞含有两组染色体组，一组来自父方，一组来自母方，用2n表示。其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。每一个配子带有一组染色体叫做单倍体，用n表示，两性配子结合后，具有两组染色体，成为二倍体的体细胞。染色体在复制以后，纵向并列的两个染色体，往往通过着丝粒连在一起。着丝粒在染色体的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂，造成中间着丝粒、亚中间着丝粒、亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。此外，有的染色体还含有随体和次级缢痕。所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型。该方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理得方面广泛应用。 核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。求取已下三个参数： （1）染色体的相对长度（2）臂比率（3）着丝点指数A组：包括1～3号染色体，用M表示。 B组：包括4～5号染色体，用SM表示。 C组：包括6～12号染色体，用SM表示；和X染色体。 D组：包括13～15号染色体，用ST表示。 E组：包括16～18号染色体，用16M、17M和18SM表示。 F组：包括19～20号染色体，用M表示。 G组：包括21～22号染色体，用ST表示；和Y染色体。 2.实验材料、仪器 2.1实验试剂 RPMI-1640培养基（包含小牛血清、双抗（由100U/ml青霉素和100U/ml链霉素制成，最终浓度为100U/ml）） 胰酶 75%酒精 磷酸缓冲液（PH=6.8） PHA（植物血球凝集素） 1mg/ml秋水仙素(4℃保存，使用时须按要求用生理盐水稀释) 低渗液（0.075 mol/L KCl） Carony固定液（甲醇：冰醋酸=3:1) Giemsa染液（Giemsa原液：磷酸缓冲液=9:1） 2.2实验材料 人外周静脉血 2.3实验器材 超净工作台、37℃恒温培养箱、普通光学显微镜、倒置显微镜、酒精灯、培养瓶、橡皮瓶塞、75％酒精棉球、离心机、定时钟、试管架、 手术镊子、吸管、水浴箱、打火机、记号笔、封口膜 3.实验方法 3.1外周血淋巴细胞培养 1）完全培养基配制 RPMI-1640培养基中含有血清（占10%）、双抗（达到工作浓度为100U/ml） （本步骤已由实验室完成） 2）采血:去医院采男、女生肘静脉血各2ml。向2个培养瓶中各加入5ml完全培养基、 PHA 100ul，然后分别接种0.3ml（15~20滴）全血，摇匀。 3）培养：置于37℃培养箱中培养68h左右。在培养期间，定期轻轻摇匀（每8h左右摇一次），使细胞充分与培养基接触。在培养过程中，要不断观察细胞的生长状况，当细胞处于繁殖期时（大约在60h左右），可加入秋水仙素（即大约在终止培养前4~8h加入秋水仙素），其最终浓度为0.5 ug/ml~1.0 ug/ml。 3.2