2013-2014学年高二生物（浙科版选修1）学案：第四部分《DNA片段的PCR扩增》.docVIP

DNA片段的PCR扩增 PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。 细胞内DNA复制条件分析： 条件 组分 作用 模板 DNA的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 酶 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物 一小段单链DNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点 PCR反应体系 10x Buffer 5 μL MgCl2（25mM） 5 μL dNTP (2.5mM) 1 μL 上游引物(10pmol) 1 μL 下游引物(10pmol) 1 μL Taq酶（5u/μL） 0.5 μL 模板DNA 1 μL ddH2O 35.5 μL Total 50 μL 二、PCR的反应过程 1.变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。 2.复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3.延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94°C，10min － － 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 72℃，10min 三、PCR产物的检测 （1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。 （2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶。在锥形瓶中，称取一定量的琼脂糖粉，加入适量蒸馏水，在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60 ℃，倒入电泳槽中，待其凝固。 （3）配制倍的TE电泳缓冲液100 mL。（4）向电泳槽中缓缓倒入配制好的电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。如果样品孔内有气泡，应设法除去。 （5）在DNA样品中加入相当于样品0.2倍体积的载样缓冲液），混匀后，加入样品孔内。 （6）接通电源。一般红色代表正极，黑色代表负极。DNA样品是由负极向正极移动，因此要保证靠近加样孔一端的电极为负极。电压为1～50 V/cm(长度以两个电极之间的距离计算)。 （7）当指示剂移动到凝胶时，断开电源，终止电泳。一般200～400个核苷酸长度的PCR产物，在50 V电压下，电泳20～40 min即可。 （8）将凝胶放入溴化乙锭溶液）中染色后，在紫外仪上观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。 PCR反应程序设置R的常见问题 假阴性，不出现扩增条带　　模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。　　物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，