硫磺矿硫化叶菌耐酸α淀粉酶基因的克隆及其在枯草芽孢杆菌中的表达.pdfVIP

硫磺矿硫化叶菌耐酸α-淀粉酶基因的克隆及其在枯草 芽孢杆菌中的表达 1 1 2 3 2、3* 蒋专 ，杨慧芬 ，邱并生 ，汪兵 ，杨建国 1 （北京科技大学土木与环境工程学院 北京 100083） 2 （中国科学院微生物研究所 北京 100080） 3 （北京中天诺亚体育科技有限公司 北京 100089） 摘 要：以硫磺矿硫化叶菌基因组DNA 为模板进行 PCR 扩增，得到其淀粉酶基因。将该 片段与载体pSBPYF 连接后转化枯草芽孢杆菌DB 1342 ，得到重组菌株DB 1342(pSBA) ，对 该菌株进行培养，经蔗糖诱导表达，在其上清中可检测到 α-淀粉酶活力，比空载体的淀粉 酶活力高了3 倍多。该酶作用的最适pH 值为4.3 ，最适作用温度为80℃，在酶液中添加不 同的金属离子均降低酶活。 关键词：α-淀粉酶，硫磺矿硫化叶菌，克隆和表达，枯草芽孢杆菌 在淀粉水解工艺中，耐高温α-淀粉酶的应用极大地提高了淀粉液化的效率。但目前应用 于工业上的地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶其最适pH为 6.0 左右[1]，液化完成后进行糖化时所 用的糖化酶最适pH为 4.5，需要进行pH值的调整，这样不但增加了生产成本，而且会影响液 化糖化效果，因此研究和开发耐酸耐高温的α-淀粉酶将大大改进淀粉工业的状况。 近年来人们从嗜热古菌中分离了多种耐热α-淀粉酶，其中Py rococcus furiosus 的胞外α- 淀粉酶因其耐酸热的性质受到国内外研究者的广泛关注，并将其在大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 [2-6] 以及酵母中进行了表达纯化及性质研究 。而古菌Sulfo lobus solfataricus 由于其生长最适pH 值为 3，嗜热嗜酸，其α-淀粉酶的应用是改进这一淀粉工艺的理想用品。但由于嗜热古菌本 身所产生的酶水平较低，远远达不到生产上的用量，而其α-淀粉酶的胞外表达尚未见报道。 本工作首次从极端嗜热耐酸古菌硫磺矿硫化叶菌中克隆到淀粉酶基因并在枯草芽孢杆菌中 得到表达，从而获得耐酸热的α-淀粉酶。 1 材料和方法 1．1 材料 硫磺矿硫化叶菌(Sulfol obus solfataricus P2)基因组 DNA 为中科院微生物所黄力教授惠 赠。 质粒 pSBPYF 由本实验室构建。 受体菌 TOP 10 购至天为时代有限公司，受体菌 DB 1342 为本实验室保存。 1．2 酶和试剂 限制性内切酶、T4DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶等工具酶及核酸和蛋白质分子量标准 等分别购自华美公司、上海生工公司、Promega 公司、天为时代公司等。可溶性淀粉购自上 海化学试剂公司。 1．3 培养基、培养条件及诱导表达条件 细菌培养用LB培养基，枯草杆菌感受态制备用GMI，GMII培养基，枯草杆菌工程菌表 * 通讯作者 E-mail ：jiangy angg@ 此研究由北京中天诺亚体育科技有限公司资助 -1- [7] 达用 2 ×MSR培养基 。B.subtilis转化采用化学感受态转化法，淀粉酶基因的表达按文献[8] 进行。 1．4 分子克隆技术和表达产物的 SDS－PAGE 分析 参照文献[9]进行。 1．5 酶活力测定方法 在Young等[10][11]方法的基础上作了改进：取 5 mL 0.5 ％的可溶性淀粉，在 80℃水浴预热 10 min ，加入经磷酸二氢钠－柠檬酸缓冲液稀释的酶液 0.5mL ，准确保温 5min 。用 2mol/L 的H SO 终止反应。取 0.5 mL反应液与 5 mL稀碘液显色，在 620 nm处测光密度。以0.5 mL 2