胰高血糖素样肽2对原代培养大鼠小肠黏膜上皮细胞的作用研究.pdf

胰高血糖素样肽．2对原代培养大鼠小肠 黏膜上皮细胞的作用研究 硕士研究生： 程潇钰 指导教师： 邹 原 教授 专业名称： 生理学 中文摘要 目的： 胰高血糖素样肽-2(glucagon—like 一种肠上皮特异性的促生长因子。它是胰高血糖素原基因在肠道内分泌 L细胞特异表达翻译后处理加工的产物。研究认为GLP一2能促进正常小 肠粘膜生长，增强肠道屏障功能，并能促进几种慢性肠病和肠道炎症引 起的肠粘膜损伤的修复和愈合。因此GLP．2在肠粘膜损伤性疾病中具有 临床应用价值。 目前国内外关于GLP．2的研究都集中在整体水平，在整体动物模型 中观察其对肠道的保护及修复作用。我们前期研究结果表明，GLP．2对 小肠缺血／再灌注损伤引起的肠屏障降低、对移植小肠功能的恢复具有积 极的作用。在离体细胞水平的研究由于肠黏膜上皮细胞分离及计数的困 难而止步不前，因此，GLP．2的作用机制目前仍不十分清楚。 本实验通过分离、制备大鼠小肠黏膜上皮细胞，利用原代培养的肠 黏膜上皮细胞，在细胞水平上研究GLP．2的作用，从而为深入探讨GLP-2 的作用机制提供重要的细胞模型。 方法： 本研究选取新生24小时的SD大鼠，取出全段小肠后，首先机械分 离出肠粘膜上皮组织，然后用酶消化的方法分离出肠隐窝细胞团进行培 养，6至8天后观察到铺路石样成片细胞即为肠黏膜上皮细胞：本实验 以复孔为单位，每6个复孔为一组，对实验结果分组进行统计。实验分 以下四步进行： GLP一2组、 GLP．2组、20nmol／L 一、实验分为对照组、2nmol／L 200nmol／L GLP．2组四组，分别在细胞接种后生长的第4小时、第2天、 第4天和第8天观察各浓度GLP．2对小肠黏膜上皮细胞的影响。 二、在细胞培养的第4小时、第2天、第4天、第6天及第8天进 行四甲基偶氮哗盐(MTT)检测，以检测促增殖效果最显著的GLP．2剂 量及作用时间与效应的关系；选用促增殖效果最显著的GLP．2剂量检测 其在第2天、第4天及第6天刺激肠上皮细胞增殖细胞核抗原(PCNA) 的表达情况，以观察GLP．2的促进细胞增殖作用。 三、分别在细胞培养的不同时期检测GLP．2受体的分布，以进一步 研究GLP．2作用机制。 四、将肠上皮细胞分为对照组与GLP一2作用组，应用过氧化(H202) 氢损伤，检测乳酸脱氢酶(LDH)、超氧物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)， 以研究GLP．2对小肠黏膜上皮细胞的损伤保护作用。 结果： 一、小肠黏膜上皮细胞的原代培养 形态学观察显示，接种的肠隐窝细胞在培养2．4天后开始伸出伪足， 贴壁生长，以单个细胞分布或呈小簇状，细胞为梭形或多角形：6至8 天后形成细胞集落；8至l 0天后，细胞汇合成片，可观察到铺路石样的 小肠黏膜上皮细胞；11天后细胞停止生长。肠粘膜上皮细胞的成功培养， 为后续实验提供良好的细胞模型。 二、GLP．2具有显著刺激小肠黏膜上皮细胞增殖的作用 MTT结果显示，与空白对照组相比，所有剂量组都具有统计学意义， 刺激小肠黏膜上皮细胞增殖的作用。PCNA观察结果显示，给药组第4 天开始出现阳性染色；第6天大部分细胞核阳性染色，促增殖作用最强。 三、GLP．2受体的表达 通过用免疫细胞化学的方法对GLP．2受体进行检测，分别在细胞生 长的早中晚期的肠粘膜上皮细胞、纤维母细胞及小肠内分泌细胞中观察 到GLP．2受体的存在。 四、GLP．2对小肠黏膜细胞过氧化氢损伤具有保护作用 在细胞生长第6天分别在对照组和给药组加入过氧化氢，并进行 GLP．2 LDH、SOD、MDA检测，结果显示，与损伤组相比，20nmol／L 9．36％，P0．0