植物激素的酶联免疫吸附测定法(ELISA).pptxVIP

植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）;免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的。 植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式，一种是在固相载体上包被抗体（直接法），另一种是包被抗原（间接法）。 直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。;间接法的原理可用下式表示： Ab+H+HP=AbH+AbHP 其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H量的多少。;材料、试剂及设备 (1) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ?12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。 (2) 样品稀释液：500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20，0.5g明胶（稍加热溶解）。 (3) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7?H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO4?12H2O，用量筒加1 000ml蒸馏水，再加1 ml Tween-20，pH为5.0。 (4) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。 (5) 终止液：2mol/L H2SO4。 ;实验步骤 一、竞争：即加标准物、待测样和抗体。 加标样及待测样： 取适量所给标样用样品稀释液配成：IAA标准曲线的最大浓度为100ng/ml。然后再依次2倍稀释8个浓度（包括0ng/ml ）。将系列标准样加入96孔酶标板的前两行，每个浓度加2孔，每孔50μl,其余孔加待测样，每个样品重复两孔，每孔50μl。 加抗体：在5ml样品稀释液中加入一定量的抗体,混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。 竞争条件37℃左右0.5h。 ;洗板：将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。共洗涤四次。 加二抗：将适当的酶标二抗加入10ml样品稀释液中（比如稀释倍数1:1000就加10μl），混匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入湿盒内，置37℃下，温育0.5h。;洗板：方法同竞争之后的洗板。 加底物显色：称取10-20mg邻苯二胺（OPD）溶于10ml底物缓冲液中，完全溶解后加4μl 30% H202混匀（显色液要现用现配），在每孔中加100μl，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。 比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。;结果计算： 曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/ml ）的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit值的计算方法如下： B/B0 B Logit（B/B0）=ln———— =ln———— 1-B/B0 B0-B 其中B0是0ng/ml孔的显色值，B是其它浓度的显色值。 待测样品可根据其显色值的logit值从图上查出其所含激素浓度（ng/ml）的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度（ng/ml）。 求得样品中激素的浓度后，再计算样品中激素的含量（ng/g?fw）。