甜菜夜蛾幼虫脂肪体细胞建系方法探讨.pdfVIP

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2009, 31(5): 726730 甜菜夜蛾幼虫脂肪体细胞建系方法的探讨 瑄 * 张　寰　李　 　苗　麟　王红托　张爱君　杜　贺　杨　青　秦启联 (中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京100101) 摘要　　本研究以甜菜夜蛾幼虫脂肪体组织为材料,探讨最初该细胞通过原代培养从组织中 游离出不断增殖,经过数次传代,最终建立细胞系的过程以及培养过程中污染控制、培养基结晶对 原代培养的影响等。结果表明,贴壁处理对原代细胞的游离具有重要作用,经贴壁处理,有62%的 培养出现游离细胞;游离出来的细胞持续增殖,能够布满培养表面并进行传代的比率为33%;最终 有15%的原代培养建系成功。起始培养至首次传代成功的平均时间是85天。污染和培养基结晶是 原代培养失败的重要原因之一。 昆虫细胞系最重要的应用就是研究杆状病毒,或 1.2主要试剂 者通过杆状病毒载体系统表达外源蛋白质。由于杆 细胞培养液TNM-FH购自Sigma公司(Cat. No. 状病毒复制和感染的专一性,每种病毒的扩增都需要 T1032),配制时加入10 U/ml青霉素和10g /ml链霉 相应同源的细胞系。缺乏对特定病毒敏感的细胞系, 素;胎牛血清 购自哈尔滨江 已经成为该病毒相关研究的瓶颈。因此,更多种类和 海生物工程公司。苯基硫脲 为 来源的昆虫细胞系一直受到昆虫病毒研究者的欢迎, 国产分析纯。 也是昆虫病毒学研究的重要内容之一。昆虫细胞原 PTU饱和TNM-FH培养液:在TNM-FH培养液 代培养工作十分繁琐,环节很多,探讨培养条件和操 中加入过量的PTU晶体,充分搅拌后,静置过夜。取 作细节,对于成功建立细胞系具有十分重要的意义。 上清液过滤除菌。 昆虫的脂肪体同哺乳动物的肝脏具有相似的功 原代培养液:其中TNM-FH、FBS、PTU饱和 能,是重要的生理代谢组织,也是杆状病毒侵染、复 TNM-FH的比例为8∶1∶1。 制的主要部位之一。目前已经建立了约30株昆虫脂 传代细胞培养液:含有10% FBS的TNM-FH。 肪体或脂肪体与卵巢混合物来源的细胞系,数量仅占 条件培养液:甜菜夜蛾脂肪体细胞系IOZCAS- [13] 所有已建立昆虫细胞系的5%。目前,虽然有关新的 Spex-II传代培养于含10% FBS的TNM-FH培养 昆虫细胞系建立及特性的报道较多,但对细胞系建立 液中,当细胞生长到对数生长期时,吸出其中的培养 [1~ 12] 液, 1 000g离心10 min,吸取上清液,用0.22m的滤 方法的探讨较少 。本研究以甜菜夜蛾脂肪体组 织为实验材料,探讨昆虫脂肪体细胞系建立的方法,其 膜过滤后备用。条件培养液现配现用。 中包括原代培养的条件,最初几次传代培养过程中的 1.3原代培养 相关因素,如取材的虫龄、脂肪体组织块大小、对 在超净工作台内,将末龄后期至化蛹前甜菜夜蛾 组织块的处理、培养基是否出现结晶等,以及这些 幼虫浸于70%乙醇,体表消毒10~20 min,用无菌吸 因素对培养过程中细胞在体外分离和增殖的影响。 水纸吸干虫体表面的乙醇,放入装有Ringer’s生理盐 水的培养皿中解剖虫体,获得脂肪体组织,充分清洗 1材料与方法 脂肪体组织以除去血细胞,将多块脂肪体组织用尖嘴 2 1.1材料 镊转移到含有1 ml原代培养液的T-25