三蛋白质的研究方法2013.ppt

主要内容 蛋白质对象的选择和样品的获取 蛋白质的检测和鉴定 蛋白质的结构分析 蛋白质生物功能检测 蛋白质对象的选择和样品的获取 直接从生物组织中提纯蛋白—— 蛋白质的分离纯化包括以下过程： 1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来； 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来; （盐析法或有机溶剂法） 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开； 4.蛋白质结晶； 5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。 根据基因组测序获得的信息 （1）可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。 先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获 得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白 （2）去获得有关基因的cDNA全序列，然后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。 有偏差，甚至完全是假象。 即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后的RNA加工，翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。 3.交替冻融法： 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀 而使细胞胀破。 4.超声波法： 利用超声波震荡，使细胞膜上所受张力不均而解体。 5.酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等对 　细胞膜或细胞壁的分解作用，使它们解体 膜固有蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。 蛋白质的胶体性质： 蛋白质颗粒表面多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面成有一层水膜，蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。 此外，蛋白质表面可带有电荷，可起胶粒稳定的 作用。 若去除蛋白质胶体表面电荷和水化膜两个稳定因素 ，蛋白质极易从溶液中析出 常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。 如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。 缺点： 易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。  双向PAGE 凝胶层析 1.凝胶是一类多孔性高分子聚合物,每个颗粒犹如一个筛子.当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱; 2. 反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱. 蛋白质研究方法复习题 1.简述蛋白质的分离纯化过程。 2.去污剂的作用及分类 3.盐析的原理。盐溶 盐析 4.离子交换层析和凝胶排阻层析的原理。简述常用作凝胶的载体物质的种类 5. 等电聚焦电泳的原理 6.蛋白质印迹 7.简述Edman降解法 8.举例说明蛋白质生物功能研究的方法。 四、测定蛋白质的氨基酸序列 蛋白质被纯化出来，需要进一步获取其基因序列， 最好测定其部分的或全部的氨基酸序列。 　自动氨基酸测序仪 五、用抗体探测特异蛋白质分子 抗体是当外源入侵物（包括蛋白质）与脊椎动物体内的免疫系统接触后产生的、能与入侵物特异结合的防御性蛋白质分子。 这种高度特异、高度灵敏的抗体一抗原结合反应现在被广泛地应用于检测微量蛋白的存在情况。 2.优点：具有高度的吸附专一性 层析过程简便、快速 3.载体的选择： (1)必须具有高度亲水性，使Pr分子容易与它接近. (2)非专一性吸附要十分小。 (3)必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。 ? 常用载体：纤维素、 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、 聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。 高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLC） 又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 HPLC包括：