《7层析》.doc

第七讲 层析 4学时 一、通过本章学习应掌握的问题 1、什么是色谱分离技术？ 2、色谱分离技术的分类？ 3、什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？ 4、什么是吸附色谱及其分类和基本原理？ 5、什么是分配色谱？ 6、离子交换色谱的分类及应用 7、凝胶色谱的分离原理及分类 8、离子交换及疏水作用层析的原理 9、高效液相色谱的分离原理及应用？ 10、蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？ 二、什么是色谱技术（Chromatography） 概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 简单的说，色谱技术是在特定的色谱柱当中，利用不同物质与固定相的亲和力差异而实现分离的一组技术。其优点是分辨率高，是生化产品纯化、分析的重要手段，这一切均源于其特殊的分离模式，即塔板理论 三、色谱分离方法的分类 色谱分离方法很多，种类有四、五十种。但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种： 1、吸附色谱 2、分配色谱 3、离子交换色谱 4、凝胶色谱 四、色谱分离的基本概念 1、分配系数：可由Langmuir方程得出 Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度 2、保留时间（tR）和保留体积（VR）：反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一 3、色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 理论塔板高度： L---柱长 五、吸附色谱 1、原理：利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离 2、关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动相）的选择 3、吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2 4、常用的吸附剂： 氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素、聚酰胺、硅藻土 5、展开剂的选择 展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力 6、吸附色谱的操作程序 （1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 （2）吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 （3）洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物 六、分配色谱 1、原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法 2、构成要素：固定相、载体、流动相 载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类： 硅胶、硅藻土、纤维素、葡聚糖凝胶 固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相 流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱） *反相色谱 固定相是非极性的流动相是极性的 3、HPLC（High Performance Liquid Chromatography） 是一种典型的分配色谱，它是基于化合物在固定相和流动相之间分配系数的差异而实现分离的，由于经过了多次的吸附－解析－吸附的过程，其理论塔板数可高达数万（分析性HPLC） 4、反相液相色谱 反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求 载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm ） Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基 流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃 七、离子交换色谱 1、概念：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法 2、常用的离子交换树脂 （1）葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 （2）纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 （3）琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂 （4）