油茶内生拮抗菌Y13定殖动态与防治炭疽病作用机理.pdf

摘要 oleifera 油茶炭疽病(Camellia anthracnose)是我国油茶的主要病害之 一，严重引起落花落果，大大降低了油茶产量。目前对于油茶炭疽病的防治主 要是化学防治，但化学农药残留严重污染了环境和生态安全，并且有害生物的 抗药性也日益严重。生物防治具有安全、高效及无污染等特点，因此已经成为 防治植物病害的重要途径，受到人们的广泛关注。本实验室从油茶健康叶上分 离得到的一株对油茶炭疽病具有良好防治效果的内生细菌Y13，经鉴定该菌株 为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。我们研究发现，Y13对油茶炭疽病有较 好的防治效果，但田间试验效果不稳定。为了有效利用此菌株，本论文以内生 细菌Y13为对象，研究Y13在油茶体内的定殖动态及对炭疽病菌的作用机理， 主要研究结果如下： (1)油茶内生拮抗细菌Y13在体内的定殖动态。采用抗生素标记法对Y13 进行筛选，得到了抗利福平菌株Y138；通过盆栽试验，采用喷叶，灌根和蘸根 三种处理方式对油茶苗进行Y13接种处理，在不同时间内测定了在油茶根、茎、 叶内Y13的定殖数量，不同处理方法均可使Y13在油茶体内各部位定殖，喷叶 接种法只能在油茶叶及茎内检测到Y13菌株，根内检测不到，且Y13种群数量 在油茶茎叶中呈现先上升后下降的趋势，第10d左右叶中定殖量达到高峰，为 5．88×103cfu／g，第25d时，茎中已检测不到Y13菌株，在叶中的定殖量仍可 X 达1．8 103cfu／g；蘸根处理中，Y13在根、茎中数量呈逐渐下降趋势，在叶片 中数量逐渐上升，20d左右有所下降，到25d左右定殖量稳定在1．28×103cfu／g 左右；灌根处理与蘸根处理相似。从Y13在油茶体内的定殖部位来看，Y13在 叶中的定殖量最多，根和茎中较少，从不同的处理方式比较，喷叶接种法Y13 定殖量较大，其次是蘸根和灌根。 (2)Y13抗菌活性物质的分离及其特性研究。通过平板对峙培养法，测定 了Y13发酵滤液对油茶炭疽病的抑菌效果可达61．2％，说明Y13分泌有效抑菌 活性物质至胞外；对发酵滤液利用有机溶剂提取活性物质结果表明：该活性物质 不溶于有机溶剂，可被甲醇、乙醇沉淀，说明该物质极性较大；采用酸碱沉淀 法提取活性物质结果表明，活性物质可在酸性条件下沉淀出来，且pH2—3时沉 淀活性最强：采用不同浓度硫酸铵盐盐析法提取活性物质，结果表明，活性物 质可被硫酸铵盐析沉淀，且在70％的硫酸铵饱和度下粗提物的拮抗活性最大： 硫酸铵盐析物经3500Da透析袋透析后测定其活性也可达39．8％，推测该类活性 物质为抗菌蛋白类物质。对活性粗提物进行理化性质研究，结果表明，该活性 物质对热较稳定，对紫外线照射不敏感，在中性pH条件下较稳定，在强碱条件 下不稳定，在酸性条件下易产生沉淀，对胰蛋白酶不敏感，对蛋白酶K部分敏 感。 (3)Y13对油茶炭疽病诱导抗性机制。通过Y13诱导处理及炭疽病菌接种 油茶苗，测定了不同接种时间油茶体内的PAL、POD、SOD、PP0等酶活性及MDA 含量和活性氧产生速率变化，结果表明，Y13诱导处理后，PAL、POD、PPO和 d SOD活性明显增强。同时Y13和炭疽病处理组诱导处理第3PAL活性达到最 大，为对照的2．9倍，只接种Y13及炭疽病处理组PAL活性于第5d达到高峰， d活性最高，分别比对 分别是对照组的2．1和2．8倍；POD和SOD诱导后第5 照增加了15．5．29．5及8．5．20．5个酶活性单位；PPO诱导后3d达活性高峰，7d d最大，比对照增加80．6％，10d左 后迅速下降。活性氧(023产生速率诱导后l 右接近对照，Y13单独诱导和同时Y13和炭疽病菌诱导均使MDA含量在第ld 时迅速下降，第3d左右比对照下降了36％。Y13通过诱导油茶体内相关抗病基 因的表达，从而增强了油茶内防御酶SOD、POD、PP0等活性，减少油茶内活性 氧物质，降低了膜脂过氧化程度，从而增强了油茶综合抗病能力。 关键词：油茶；炭疽病菌；拮抗内生细菌；定殖；作用机理 Ⅱ