定量PCR技术实验解析.pptVIP

实时荧光定量PCR的技术与应用 (Real time Quantitative PCR) 　　　　　　　 东胜创新生物科技有限公司 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用 实时荧光定量PCR技术原理 实时定量PCR技术研究进展与应用 基因表达分析——定量 多态性检测（SNP分析）——定性 定量PCR实验技术解析 什么是荧光 原子核，电子 能级，稳定 电子被激发（高能量的光线，热量……）到高能级，不稳定 电子回到低能级，放出能量（光，热） 可见光范围，荧光 常规vs实时 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析 实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析 常规vs实时 优缺点比较 优势来自： 实验数据及定量分析方法 荧光实时监测产物浓度 实验数据 实时荧光PCR荧光曲线图 循环数，荧光值 指数扩增期，非指数扩增期 实时荧光定量PCR原理之　如何定量 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——原理篇 C(t)值： 对于同一PCR反应而言，模板浓度相同时， C(t)值极具重复性； 对于同一PCR反应而言中，模板浓度越高，到达某一域值时对应的C(t)值就越小，反之，则越高； 在指数增长期内，初始模板的Log浓度与c(t)值呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（即C(t)值）就可计算出样品中所含的模板量。 定量原理 浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——原理篇 定量方法：初始模板量的对数与C(T)循环数之间呈线性关系 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——原理篇 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——原理篇 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——原理篇 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——原理篇 延伸反应: Taq酶切下5’端荧光素出现荧光 小结 实时荧光定量PCR 各种荧光监测方法的原理 实时荧光数据结果的初步分析 C(t)值 线性关系 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用 实时荧光定量PCR技术原理 实时定量PCR技术研究进展与应用 基因表达分析——定量 多态性检测（SNP分析）——定性 定量PCR实验技术解析 绝对定量与相对定量 绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA） 病毒DNA或RNA的拷贝数 转基因的拷贝数 相对定量：计算初始反应模板的相对含量 差异表达分析 芯片评估 转基因生物的检测 基因型检测 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇 基因表达差异 　绝对定量——标准品（病毒检测，GMO检测等） 　相对定量 外标法——内对照与待检目标在两个管中进行同时扩增 内标法——内对照与待检测目标在同一管中进行扩增 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用 实时荧光定量PCR技术原理 实时应用定量PCR技术研究进展与应用 基因表达——定量 多态性检测（SNP分析）——定性 定量PCR实验技术解析 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇 SNPs是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换或颠换变异所引起的DNA序列多态性 SNP共有4种形式,其中C→T(G→A)转换常见,约占2/3,其余3种置换为C→A(G→T)、C→G(G→C)和T→A(A→T) SNP占所有已知多态性的90%以上，SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多 实时荧光定量PCR技术研究进展与应用——应用篇 进行疾病的遗传连锁分析(linkage analysis)及关联分析(association analysis)，用于疾病易感基因定位；而且其定位的精度将比微卫星标记精细得多，可直接用于指导易感基因克隆。 在“药物基因组学”(pharmacogenomics)研究中，可通过检测SNP的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的根本原因。 也可用于法医研究的罪犯身份的鉴别、亲子鉴定等，此外在器官移植中供体和受体间的配对选择及物种进化的研究中都将具有重要意义 两条探针分别针对不同等位基因 SNP placed in the center of the probe Quencher; TAMRA or MGB/NFQ* 实时荧光定量PCR技术研究进展