胶质瘤干细胞的生物学特性及和胶质瘤血管发生的关系.pdf

胶质瘤干祖细胞的生物学特性及其与肿瘤血管发生的关系 中文摘要 胶质瘤干祖细胞的生物学特性及其与肿瘤血管发生的关系 中文摘要 一、研究背景与目的 虽然大家都知道，血管发生（angiogenesis ）的过程对于胶质瘤的生长、恶性浸 润等特性来讲是一个关键性事件，但如何发生的，研究者苦苦地探索了数十年，至 今仍有争论，特别是随着本世纪初才发现的肿瘤干细胞以及与之相关的肿瘤干细胞 微环境(Niche)研究的深入，对肿瘤血管的生成有了新的认识，目前有如下三种观点： A.肿瘤细胞诱导宿主血管内皮细胞增生,出芽,迁移后形成； B.先由肿瘤细胞随机排列组成,而后刺激宿主内皮细胞加入； C.依托肿瘤干细胞巢(Niche,微环境)转分化形成。详见英文摘要中的图 1。 本研究主要在自建的胶质瘤干/祖细胞(Glioma Stem/Progenitor Cells，GSPCs) 基础上探索其与肿瘤血管生成的关系，即是否存在图 1 中的C 模式。 二、实验方法 1 建立 GSPCs 体外生长模型：用新鲜的恶性胶质瘤临床标本消化成单细胞悬 液，在无血清(含生长因子)条件下于 CO2 箱中培养，再从呈悬浮生长的肿瘤球中用 CD133 免疫磁珠分离阳性细胞，单克隆后一部分液氮冻存;另一部分在含血清(不含 生长因子)条件下培养，作干祖细胞和分化细胞相关标志蛋白的流式细胞及细胞化学 检测，最后用 GSPCs 球吹打成单个细胞进行裸小鼠脑尾状核移植，观察致瘤情况。 2 建立RFP/GFP可移植性肿瘤模型与检测血管:用经病毒载体转染红色荧光蛋 白(Red Fluorescent Protein，RFP)基因的GSPCs，接种于本室培育的表达绿色荧光蛋 6 白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因的NC裸小鼠脑内（10μl，1×10 细胞），或皮 6 下（200μl，1×10 细胞），2～3周出现症状或恶病质时处死，取移植瘤组织压成簿片 后在荧光显微镜下观察、或用冰冻切片在荧光激光扫描共聚焦显微镜下观察肿瘤血 管. 三、结果与分析 1 GSPCs 的特征:克隆到的 CD133+细胞，在含生长因子条件下培养的肿瘤球中 I   中文摘要 胶质瘤干祖细胞的生物学特性及其与肿瘤血管发生的关系 + + CD133 细胞只占少数，多数细胞是 Nestin 细胞，免疫细胞化学染色后在共聚焦显 + 微镜下还见到即使是 CD133 细胞，也同时表达 Nestin ，据此我们用于实验的细胞都 称为胶质瘤干/祖细胞(Glioma Stem/Progenitor Cells，GSPCs)，与神经干细胞(neural stem cell，NSCs) 比，最大的不同点是在含血清条件下培养，NSCs 可分化成终末细 胞，GSPCs 不但到不了终末分化状态，而且还可以逆向分化成前体细胞.GSPCs 接 种 GFP 裸小鼠体内，无论是脑内还是皮下，都能100％致瘤，而且呈高侵袭性生长。 2 RFP/GFP 模型特征:GSPCs-RFP 细胞与 GSPCs 细胞一样，无论接种在脑内还 是皮下，也都能100％致瘤，而且呈高侵袭性生长.因为接种的肿瘤细胞与宿主细胞 分别表达 RFP 和 GFP，根据显示的红色和绿色加以区别。在荧光显微镜和激光扫描 共聚焦显微镜下，能清晰显示肿瘤细胞在对宿主组织重构过程中所发生的细胞和蛋 白质分子事件是谁起的作用. 3 被荧光示踪的肿瘤血管和宿主血管:在肿瘤组织中，见到了参与组成肿瘤血 管壁的细胞或血管壁，有红、绿和黄三种颜色，红、绿分别代表来自接种肿瘤细胞 的子代细胞和宿主组织来源的细胞;黄色的则是红、绿两种细胞相互融合的细胞。在 肿瘤组织压片，所取的组织最终压成的厚度大约在20μm ，比通常5μm 的病理切片要