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PCR发展历程 荧光定量PCR – 第二代 荧光定量PCR – 第二代 荧光定量PCR – 第二代 荧光定量PCR – 第二代 荧光定量PCR应用 MIQE 微滴式数字PCR原理 (To be or Not to be) BIO-RAD定量产品线 降低原材料成本 本文反映结束！ 谢谢大家观看！ 同步糖化发酵工艺 ，能耗下降30% 热循环系统 专利的“蜂巢式”加热模块 升温速度：5℃/s 降温速度：5℃/s 热循环系统 dynamic thermal gradient 10oC Above 6oC Below 利用温度梯度优化体系 软件 一、CFX Manager 软件 ----------可同时控制4台定量PCR仪器 ----------功能强大，提供所有的定量数据分析方法 如-△Ct，2 - △ △ Ct 多参照基因分析和扩增曲线计算，多个数据文件的基因表达分析（1次最多可分析5000个孔的数据），等位基因分析，终点分析等，所有数据结果可以Excel,Word,Powerpoint或PDF格式保存。软件除了无限制随意安装外，还有中英文版本。 二、精确熔点分析软件 ----------应用的拓展，可以使用HRM软件进行SNP（单核苷酸多肽性），甲基化等方面的研究。 实验向导 软件 CFX Manager 软件 Protocol的编辑 软件 CFX Manager 软件 板的编辑—非常直观；运行前、中、后均可编辑 软件 CFX Manager 软件 板的编辑—分组功能 软件 CFX Manager 软件 最终数据结果，一一对应 软件 CFX Manager 软件 数据分析界面 软件 Inter-run calibration 软件 多板数据比较时，需要进行板间校正 相对对定量的数据处理法选择 软件 ?多内参基因的选择 ?带入实际扩增效率进行计算 软件 软件 什么是高分辨率熔解曲线分析？ 高分辨率熔解曲线分析（High-resolution Melting, HRM）是在实时荧光定量PCR 基础上发展而来的新的SNP、突变位点筛查及分型的研究方法。它是对PCR扩增产物 DNA片段进行溶解曲线定量分析，这个方法建立在“扩增子溶解曲线分析”方法基础 上，利用高度热稳定性和灵敏度的实时荧光定量PCR检测系统，配合相关专用分析软 件和饱和DNA结合染料，通过分析PCR扩增产物溶解曲线差异检测扩增序列中发生的 碱基突变。 溶解曲线：通常是为了在qPCR实验中验证引物的特异性而绘制，一般是在65℃-95℃ 之间每0.5℃为升温单位采集得到。 HRM：数据采集的温度变化单位要比平常的溶解曲线狭窄密集，一般来说需要间隔 0.2℃升温采集一次荧光信号。通过这些密集采集的数据产生高分辨率溶解曲线，并通 过这些数据对存在差异的序列进行区分。 HRM软件 软件 1 ．基因的突变扫描：是指在测序之前就能发现给定SNP位点上等位基因的变异；或是在不明确等位基因的情况下，鉴定出未知SNP位点的多态位置，部分取代和提高后继测序工作的效率 1）样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查， 2）疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的扫描，新突变的发现。 3）遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4）植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5）动植物品质相关多态性位点的研究等。 2 ．甲基化研究  1）甲基化位点的筛查  2）甲基化程度分析 3 ．等位基因频率分析 4 ．物种鉴定、品种鉴定 5 ． HLA 基因组配型 6 ．法医学鉴定、亲子鉴定 HRM应用 可兼容的定量方法： SYBR Green I、EvaGreen、Taqman探针、Beacon探针、FRET 探针等等。 可兼容的突变频率筛选（SNP）方法： 熔解曲线功能（HRM分析）、Taqman探针分析，FRET 分析 可兼容的试剂耗材种类： 所有国产与进口试剂，专业定量PCR级0.2 ml PCR 管，八连管和PCR板 开放性的系统 实例 5 2012 Life Science Research 2012 Life Science Research 2012 Life Science Research 2012 Life Science Research BIO-RAD荧光定量PCR仪 常规PCR 定性 1st 2nd 3rd 定量PCR 相对定量 微滴式数字 PCR 绝对定量 扩增结束后琼脂糖电泳溴化乙锭终点检测 条带亮度与起始浓度间没有对应关系，只能用于定性 常规PCR – 第一代 染料法 探针法 SYBR Green I qPCR 标记方法 SYBR Green I qPCR 标记