3.质粒DNA限制性酶切鉴定-2012.pptVIP

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2015-11-20 发布于安徽
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3.质粒DNA限制性酶切鉴定-2012.ppt

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实验三重组质粒DNA的限制性酶切鉴定【一、实验目的】学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。学习通过限制性酶切法鉴定阳性克隆的方法原理与技术。【二、实验原理】限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。内切酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。 37℃ 【三、实验仪器、材料与试剂】（一）实验仪器微量移液器微型离心机恒温水浴锅（二）材料和试剂重组质粒pGEM-T easy-X（3015+500bp） EcoRI（5U/ul）及其酶切缓冲液 H2O 【四、实验步骤】 1、在一个洁净的0.5 ml离心管中混匀下列反应物：反应物体积（μl）灭菌水 2.2 10×Buffer 2 质粒DNA 5 EcoR I 0.8 总计 10 2、将反应物置于37℃水浴，温浴2h。 3、琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。思考题如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能是什么原因？ * * * * * *