植物体细胞克隆技术.docVIP

体细胞克隆技术 细胞核移植：就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。 体细胞核移植(somatic cell nuclear transplantation)技术又称体细胞克隆，它是把分化程度较高的体细胞移入去核卵母细胞中，构建的生物技术。它与胚胎克隆技术相比，有两大优点:同一遗传性状供体核的数量可无限获得；第二，可通过对供体细胞的遗传改造加速新性状和优良性状的筛选胚胎移植为有性生殖，而体细胞核移植（即克隆技术）为无性生殖细胞核移植 细胞核移植，就是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个细胞里去。其状态就像是卵子受精后的细胞核一样，可以让这个“重组细胞“像受精卵一样发育成一个完成个体。 克隆羊多利（世界上第一个无性生殖产生的动物）的诞生： 步骤从一只6岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为A）的乳腺中乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”；步骤从一头苏格兰黑面母绵羊（B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”； 步骤三理论上来说把细胞核注入到去核卵母细胞中才叫细胞核移植，但实际操作起来比较难。将供体细胞注入去核卵母细胞”比较方便，不用取出细胞核即可，它是利用了细胞膜具有一定流动性的特点，通过离心、震荡、电刺激、灭活病毒等手段使供体细胞和卵母细胞细胞膜融合，成为一个细胞，从而达到将供体细胞核注入去去核卵母细胞的目的。利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”； 步骤四将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊--多莉。不同实验室的条件不同，、处理方法不同，、造成研究材料来源与卵母细胞质量、成熟培养体系、供体细胞类型、供体细胞处理方法、胚胎培养方法、融合激活方案等等因素均会影响核质的同步发育、核的重新编程和发育的启动和延续，进而影响到克隆的效率在众多影响因素中，体细胞和卵母细胞细胞周期协调更是体细胞核移植最为关键的环节全面探讨供体各方面因素对重构胚的影响至关重要。胎儿成纤维细胞、颗粒细胞、和卵丘细胞的核移植效果　成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。 颗粒细胞卵泡中卵母细胞四周有一层菱形或扁平细胞围绕，在卵泡开始发育、卵细胞成长的同时，周围的菱形细胞变为方形，并由单层增生成复层，因其细胞浆内含有颗粒，故称为颗粒细胞。颗粒细胞的胞核大而圆，着色深，细胞的游离面有许多细长突起伸入放射带的凹陷部。 研究结果表明：（1）比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现，胎儿成纤维细胞的融合率（64.74%）高于颗粒细胞的融合率（51.05%）和卵丘细胞的融合率（56.89%胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现，6～9代的融合率显著高于3～5代和≥10代的成纤维细胞细胞周期协调更是体细胞核移植最为关键的环节影响核质的同步发育、核的重新编程和发育的启动和延续，进而影响到克隆的效率这一种使细胞分裂的方法。通过降低培养液中的血清浓度，使培养细胞因缺乏血清生长因子而不能分裂，一定时间后再加入血清，细胞就开始同步生长分裂了。Aphidicolin是一种菌种中分离出来的四环二萜类抗生素和 DNA 合成抑制剂能够通过结合酶，特异性地抑制 DNA 聚合酶 α 和 δ而不影响其它 DNA 聚合酶。这种化合物能够在 S 早期阶段阻滞细胞周期， （核受体：MII期的卵母细胞（一般通过超数排卵和体外成熟培养获得），早期胚胎细胞，去除原核的受精卵） （其中我们为什么一般采用动物的卵细胞做核受体呢？是因为大部分细胞的细胞质中含有抑制细胞核的全能性表达的蛋白质，而卵细胞中没有这种物质，因此使用卵细胞能促进细胞核的全能性表达。卵母细胞进入输卵管，并停留在第2次成熟分裂中期，此时染色体都集中在赤道板位置，容易去除染色体而且此时的细胞才具备受精能力，更容易接收外源染色体MII期的卵母细胞中含有较高的成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)活性，是分化的体细胞进行去分化进而重新编程所必需的，卵母细胞此时体积较大，容易操作，且营养物质较多。一般不会采用受精卵作为核受体的，因为核移植是无性生殖的过程，而且用受精卵的话还要先去核，多此一举。） 2.2去核的方法： 1.盲吸法 2.半卵法 3.荧光引导合法 4.微分干涉显微镜