鸡蛋清溶菌酶的提取和电泳鉴定1-副本.docVIP

鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定 一、实验目的 1 了解鸡蛋清溶菌酶的性质、常用制备方法及原理 2 掌握盐析法分离蛋白质原理及操作 3 掌握SDS鉴定蛋白纯度的原理及操作 二、实验原理 盐析法 1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重要方法之一。 许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现 象称为“盐溶”（Salting in）。 而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐 析“（Salting out）。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法: 常用蛋白质纯度分析及分子量测定技术。 SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium declecyl Sulfate） 破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的共价键，使蛋白质变性而改变原来的空间构象，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在的条件下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS结合从而形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。 不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18?，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。使蛋白质的电泳迁移率仅仅取决于分子大小这一因素。 当蛋白质的分子量在11，700~165，000之间时，电泳迁移率与分子量对数呈直线关系，符合直线方程式： LgMw= —bx + k 式中：Mw为蛋白质分子量，X为电泳迁移率，k和b均为常数。利用这一关系将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳： 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N甲叉双丙烯酰胺聚合而成。在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其孔隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的孔隙度，又有比较好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶。 连续体系；不连续体系 前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein (1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 三、实验步骤 3.1 蛋清准备 取1枚鲜鸡蛋，洗净擦干，在小头用镊子轻轻捣一直径为4mm的小孔，下用烧杯或量筒接好，再在大头打一细小针孔进气，此时蛋清缓缓自动流出。取蛋清的操作应很细致，避免蛋黄破裂混入蛋清而影响实验结果。将所得鸡蛋清充分打匀（约15分钟）。打时力戒过猛以防止产生泡沫变性作用。然后用4层纱布滤去杂质，测量体积（或体重），记录pH值。 3.2 热变性 取稀盐酸调节鸡蛋清pH值 5.5左右（4-7）、70℃处理15分钟。离心，去沉淀，保留上清。 3.3 分步盐析 取适量上清，先用1N的氢氧化钠后用0.1N NaOH溶液调至pH 8.0~8.5，加60℃乙醇溶液至饱和度为10%。冰浴放置30min。离心，弃上清。（比例：800ul到eppendorf管中，加入88.9ul饱和硫酸铵）。 3.4 样品处理 取适量沉淀到干净的eppendorf管内，加200ul ddH2O溶解沉淀。加入20ulTCA， 颠倒三次，13000rpm离心10min。弃上清。Eppendorf管中加入200ul 丙酮，颠倒 三次，13000rpm离心10min。弃上清。待管内残留丙酮挥发干净，加入适量loading buffer及ddH2O，沸水浴处理15min，待电泳鉴定。 3.5 电泳鉴定 上述样品用浓度12%的SDS分析。注意加入标准对照 3.6 结果观察 染色，脱色，观察实验结果 四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作： ?实验材料和试剂 （1）丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去