5基因的体外重组与转化.ppt

第五章 基因的体外重组和转化 第一节 DNA片段的体外连接 第二节 重组体导入细菌细胞 一、黏性末端的连接 黏性末端连接(Cohesive end ligation)： 具有黏性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。 优 点 经济省时，操作方便； 外源片段容易回收； 问 题 载体自身环化 插入片段可双向插入 2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接 载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点 载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点 无相同的限制酶识别位点，有同尾酶 SalⅠ片段（CAGCTG） XhoⅠ 片段(GAGCTC) 若均不是以上情况呢？ 二、平末端的连接 平末端连接(blunt end ligation)： 在T4DNA连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。 优 点 可以用T4连接酶连接任何DNA平端 5’-突出粘性末端的补齐 可用Klenow聚合酶补齐 3’-突出粘性末端的削平 可用T4 DNA聚合酶削平 主 要 问 题 连接效率低 高浓度的底物和T4 DNA连接酶 添加凝聚剂：如聚乙二醇 不易回收外源DN