家蚕杆状病毒表达hGM-CSF纯化糖基化分析.pdf

摘要 摘要 hGM．CSF是一种重要的造血调控因子，能诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体 细胞呈集落性生长，在促进粒细胞恢复方面疗效显著，具有重要的临床应用价 值。由于糖基化程度和派生细胞类型的不同，重组细胞能产生多种形式、大小 不同的hGM．CSF，其分子量变化从16．50 kDa。糖基化可影响hGM．CSF的药代 动力学性质，抗原性和毒性，对于延长血清半衰期有很重要的作用，糖基化程 度高的动物细胞源的rhGM—CSF在体内稳定性方面优于酵母和大肠杆菌源的， 因此纯化家蚕杆状病毒表达的hGM．CSF以及分析其糖基化有一定的研究意义。 本研究首先对接种hGM—CSF的蚕蛹粉进行了Westernblot鉴定，在PVDF 膜上能杂交到特异性条带，通过夹心法ELISA检测到蚕蛹粉中hGM．CSF蛋白 的含量为2％o左右。而后开展了小规模纯化预实验，蚕蛹粉中含有大量的杂质及 油脂，因此采用高速离心、硫酸铵分级沉淀和超滤对蚕蛹粉进行粗纯化，通过 Resource Q阴离子交换色谱能使目的蛋白得到富集，进行免疫共沉淀进一步纯化 目的蛋白，得到了微量较纯的hGM．CSF。家蚕杆状病毒表达的hGM．CSF不带 His、GST等标签，只能采用离子交换色谱、亲和层析、分子排阻色谱等方法来 达到纯化的目的，而采用亲和层析方法进行大规模纯化需要大量的抗体，因此 在进行小规模纯化实验的同时，免疫新西兰雄兔制各了hGM．CSF多克隆抗体， 获得了大量多克隆抗血清，并将抗体用亲和层析柱纯化，为接下来的大规模纯 化实验奠定了基础。大规模实验通过高速离心、硫酸铵分级沉淀和超滤对蚕蛹 粉进行粗纯化，采用DEAE阴离子交换色谱和抗体亲和层析柱进一步纯化，获 得了一定量(2 F和EndoH 量也由最初的2．30％。上升到了204．50％0。利用N型糖苷酶PNGase 对较纯的hGM．CSF进行了酶切去糖基化分析，去糖基化后的hGM—CSF在 SDS．PAGE和Westernblot上显示比去糖基化前小1．2kDa，说明hGM．CSF蛋白 有N型糖苷链修饰，而去糖基化后比预期的分子量还要大，可能存在潜在的0． 糖基化。挖点对去糖基化前后的蛋白进行质谱检测，质谱鉴定结果为hGM．CSF 蛋白，SequenceCoverage达到43％。 关键词：hGM．CSF，纯化，糖基化 Abstract hGM—CSFisakindof factorof important hematopoiesis regulation，whichcan induce and granulocyte macrophage cellsin precursor andhas colonygrowth curativeeffect apparent onthe of promotion granulocyte it has recovery,thus valuein 1mportant clinical cells application．Recombinantwere