基因工程笔记..docVIP

 绪论 第一节 基因工程的诞生 第二节 基因工程的安全性 第三节 基因工程的应用 第四节 基因工程技术的商业化发展 一、定义 ※ Genetic engineering： 在外核酸分子 插入病毒, 质粒或其它载体系统中 ,再整合到那些本来不含该类物质的宿主中 从而形成一种新的可连续繁殖的有机体Clone:从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。 二、特征 1. 跨物种性 外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。 2. 无性扩增 外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。 三、基因工程的主要操作内容（供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件） 1. 目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消 化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 2. 重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。 3.重组体的转化; 将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 4.克隆鉴定:挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因） 5.目的基因表达:使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。 安全性 一、基因工程的安全措施 （1）实验室的物理安全 ① P1级实验室一般装备良好的普通微生物实验室。 ② P2 级实验室 在P1级实验室的基础上还装备有 负压的安全操作柜。 ③ P3 级实验室全负压的实验室，同时装备安全操作柜 ④ P4级实验室专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。 具有最高安全防护措施 （2）实验室的生物安全（分3 级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。） EK1：在自然环境中一般都要死亡。 EK2：在自然环境中无法存活。 EK3；应该是失去了自我迁移的能力。 （3） 载体的安全 应该是失去了自我迁移的能力。不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。（容易构建）。如pMB9，pBR322等 基因工程的应用 ppt 20页左右 第一章 基因操作的主要技术原理 第一节 DNA的提取与纯化第二节 DNA的凝胶电泳第三节 核酸的分子杂交第四节 基因 扩增技术PCR第五节 DNA序列分析第六节 酵母双杂交系统 DNA的提取与纯化 DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。 原理 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；  染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。 所用的试剂作用 ① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的(-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性 ② 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解 ③ EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 ④NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 ⑤ NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性，高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀 ⑥ 乙醇 用于沉淀DNA ，DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 ⑦ RNase A 降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 ⑧ TE缓冲液：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解 ⑨ 酚-氯仿（选用）蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。 提取质粒DNA的步骤 溶菌 破膜 蛋白质和DNA变性 中和 离心除去沉淀 纯化DNA 沉淀DNA 溶菌：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。 溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A 溶液II 0.2N NaOH，1.0%SDS 溶液III 3M