抑制消减杂交技术筛选肺癌转移相关基因的实验的研究.pdf

叫川人学临床医学博卜号业学位论义 皆师崩清牛教授 抑制消减杂交技术 筛选肺癌转移相关基因的实验研究+ 研究生：李娟 导师：周清华教授 摘要 背景与目的 肿癌的侵袭和转移是肺癌的恶性标志和特征，也是导 致肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。肺癌转移是一个多阶段、多基因 参与的复杂过程，虽然目前对肺癌侵袭转移过程中的基因变化已经有了一 些研究，但在相当长的时J日J内肺癌转移仍将是人类面临的亟待阐明和解决 的重大基础和临床问题。利用分子生物学的新技术克隆和筛选新的转移相 关基因，是解决肺癌转移问题的重点研究方向之一。抑制消减杂交 subtractive (suppression 简便易行、灵敏度高、重复性好，十分适于克隆分析某种特殊表型的目的 基因及其功能。随着SSH技术的不断完善，它被越来越多地应用于肿瘤转 ’本课题受国家自然科学基金重点项目(No和天津市科技支撑计划重点项目(No． 06YFSZSF05300)资助 抑制消减杂交技术筛选帅璃转移相关早H的实验W冗 博¨df究生牟娟 移的相关研究中。本研究的目的就是应用SSH技术构建不同转移潜能的人 大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981 M差异表达基因的消减cDNA文库 筛选、鉴定出转移相关基因的cDNA片段，为进一步克隆新的肺癌转移相 关基因及探讨肺癌转移的分子生物学机制奠定基础。 方法 (1)应用SSH技术，以人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980和 人高转移大细胞肺癌细胞株L9981为研究对象，构建人大细胞肺癌高低转 互补原理，经蓝白菌落初步筛选获得阳性克隆，再应用PeR技术对阳性克 隆进一步筛选：(3)应用斑点杂交的方法对『F向和反向消减cDNA文库进行 杂交筛选，确定差异表达片段对应的克隆：(4)对差异表达的片段进行序列 分析；(5)将序列分析结果通过NCBI核苷酸数据库BLAST信息途径，进 RNA and 行同源性检索和比对，检索数据库包括：Humanbuild36 alternate referenceassemblies，DatabaseofGenBank+EMBL+DDBJfrom sequences ESTDivisions和AllGenBaIlk+EMBL十DDBJ+PDBfbutnoEST, sequences or or2HTGS STS，GSS，environmental0，1 samplesphase sequences)。 结果 (1)成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因正向消 减cDNA文库和反向消减cDNA文库：(2)经蓝白菌落筛选和斑点杂交， 正向消减文库获得307个阳性克隆，反向消减文库获得78个阳性克隆；(3) 正向消减文库挑选55个克隆成功测序，经同源性分析最终确定差异表达基 因片段23个与己知人类全长基因具有很高相似性(95％～100％)，这些基 2 Vtt川人学临床医学博Ij专业学位论立 导岬问清牛敦授 等：(4)反向消减文库挑选31个克隆成功测序，经同源性检索和比对最终 确定差异表达基因片段16个，其中15个与人类全长基因具有很高相似性 和RPLPO等基因。1个片段和已知人类基因仅有部分相似性，表明它可能 登录号ES452735。 结论 (1)应用抑制消减杂交技术成功构建了人大细胞肺癌高低转 消减文库中筛选到的NME2、NPMI、MT 这些基因的功能主要涉及细胞