荧光定量PCR技术-讲座0515.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ 是否会有二级结构干扰？ 一步法还是两步法？ 两步法： 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。 推荐：工作的初期阶段 RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX 一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段 RealSuper 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX  Master mix的优化 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟 Fast Hotstar 抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒 CW0696 CW0704 热启动DNA聚合酶 反应条件优化 内参基因 单一特异性产物 反应效率90%-110%