调控光滑球拟酵母碳代谢流促进α酮戊二酸过量积累.pdf

摘要 摘 要 本论文以一株能在胞外大量积累丙削酸和仅．酮戊一酸的光滑球拟酵母(Torulopsis M202019,Y,J fl{发菌株，以碳主流代谢途径 glabrata)g目重维生素的营养缺陷型菌株CCTCC 中的0c．酮酸脱氢酶系(内酬酸脱氢酶系和0【．倒戊：：酸脱氡酶系)为研究对象，结合生化工 程和基因工程手段，调控碳代谢流进入TCA循环，I·dIH911断仅．酮戊二酸的进一步代谢途 径，使碳代谢流从过量积累丙酮酸转向过量积累0【一刷戊二酸，提高0【．酮戊二酸对丙酮酸 的碳摩尔比。本论文主要结论如下： 1．根据文献报道结合实验结论，选择过氧化氧和【}1氨喋呤作为·0【．酮戊二酸脱氢酶的有 效抑制剂，在Z mM过氧化氢， glabrata发酵生产a．酮戊：酸的过程巾：(1)添加6 a．酮戊二酸产量达到21．8∥L，比对照(16．8g／L)增加30．1％；(2)添加0．08laM甲氨 喋呤，Ct一酮戊二酸产量达到20．5∥L，比对照增加22．1％；(3)同时添加以上两种抑 制剂，a．酮戊二酸脱氢酶活性降低了47％，减少了a。酮戊二酸的进一步代谢，使其 产量达到了23．5∥L，比对照提高了40．1％；(4)在抑制Q．酮戊二酸脱氢酶活性的同 时，增加维生素Bl浓度至0．04mg／L时，a．酮戊二酸产量达到最大值为28．4∥L， 比对照增加69．6％，继续增加维生素Bl浓度，丙酮酸和0【．酮戊二酸产量均下降。 2．利用酶切连接技术，在体外成功构建了敲除组件Kgdl：：Kan，将该组件转化光滑球 拟酵母，筛选得到a．酮戊二酸脱氢酶系一El基因kgdl缺陷的工程菌Zglabrata kgdl：：kan。相对于出发菌株，对工程菌研究结果表明：(1)在a．酮戊二酸脱氢酶途 径受阻的情况下，细胞选择了增加乙醛酸途径流量来完成碳源的代谢，形成了TCA． 乙醛酸循环；(2)0【．酮戊二酸脱氢酶活性缺失，导致胞内NADH／NAD水平下降了 檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性分别提高了58．1％、333％和32．5％，导致胞内丙 酮酸含量下降了50．1％，琥珀酸、苹果酸和a．酮戊二酸的胞内含量分别增加了 降了29．3％，而胞内谷氨酸族氨基酸和天冬氨酸族氨基酸含量分别提高了34．7％和 26．8％。以上结论说明，a．酮戊二酸脱氢酶系在细胞能量代谢、碳源代谢和氨基酸代 谢中均起到了不可忽视的调节作用。 3．对重组菌Z kgdl：：kan的发酵特性研究发现，在静酮戊二酸脱氢酶活性缺失 glabrata 的同时增加培养基中维生素Bl浓度提高丙酮酸脱氢酶活性，a．酮戊二酸产量达到 和1．11倍。然而，相比相同维生素条件下Ⅱ．酮戊二酸脱氢酶受部分抑制的情况，却 降低了22．6％和30．7％。仅．酮戊二酸脱氢酶活性的完全缺失导致原本流量较小的乙 醛酸循环成为碳主流代谢途径，从而绕过仅．酮戊二酸这一节点完成细胞代谢，导致 摘要 碳源流失。因此，对于碳代谢流的调控，。【．酮戊二酸脱氢酶途径的部分抑制比完全 附【断更有利于0【．俐戊：酸的积累。 glabrata 4．利用酶切连接技术，在体外成功构建了表达质粒pYX．PDAl，将其转化Z 厶ura3感受态细胞，成功地筛选得到了一株过量表达丙酮酸脱氢酶的光滑球拟酵母 Z U／mgprotein，为出发 glabrata-pdal。重组菌胞内1人j酮酸脱氰酶表达活性达到0．35 菌的3．8倍。比较重组荫1引}I发荫的发酵过程曲线发现，提高丙酮酸脱氢酶活性， 可以有效促进丙酮酸的进。步代谢，并将碳代谢流导